普氏栖粪杆菌亲缘组I和/或亲缘组II成员的定量方法及其作为生物标志物的用途技术

本发明专利技术涉及一种用于普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的肠道样品的准确定量的新方法。本发明专利技术还涉及用于检测人类对象肠道疾病的方法，包括筛查、诊断、鉴别诊断、和/或监测疾病活动和/或进展，包括测定来自所述对象的肠道样品中的PHGI和/或PHGII的丰度。此外，本发明专利技术涉及用于预测药物在人类对象肠道疾病治疗性治疗中的功效的方法，该方法包括测定来自所述对象的肠道样品中PHGI和/或PHGII的丰度。道样品中PHGI和/或PHGII的丰度。道样品中PHGI和/或PHGII的丰度。

【技术实现步骤摘要】
普氏栖粪杆菌亲缘组I和/或亲缘组II成员的定量方法及其作为生物标志物的用途


[0001]本专利技术一般涉及肠道疾病的诊断和分类以及个体化医学领域。本专利技术还涉及微生物学和分子生物学领域，更特别地，其涉及肠道微生物群组成和肠道疾病(例如炎症性肠病(IBD))之间的关系。具体地，本专利技术涉及一种用于普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的肠道样品的准确定量的新方法。本专利技术还涉及用于检测人类对象肠道疾病的方法，包括筛查、诊断、鉴别诊断、测定疾病活动和/或监测疾病活动和/或进展，包括包含测定来自所述对象的肠道样品中的PHGI和/或PHGII成员的丰度。此外，本专利技术涉及用于预测药物在人类对象肠道疾病治疗性治疗中的功效的方法，该方法包括测定来自所述对象的肠道样品中PHGI和/或PHGII的丰度。

技术介绍

[0002]炎症性肠病(IBD)代表一组特发性慢性炎症性肠道病症。该术语涵盖的两个主要疾病类别是克罗恩病(Crohn
’
s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，两者具有重叠和独特的临床和病理学特征(World Gastroenterology Organisation Global Guidelines,Inflammatory bowel disease:aglobal perspective,June 2009；and Silverberg et al.,Can J Gastroenterol.2005,19Suppl A:5
‑
36)。
[0003]在美国IBD影响多达160万人，在欧洲影响多达220万人。在世界范围内发病率正在上升，尽管IBD治疗取得了进展，但自1990年以来，在美国，IBD住院率和手术率显著增加。IBD是美国最常见的五种胃肠病负担之一，并且每年总体保健费用超过17亿美元。发达国家每1000人中就有一到两人受IBD的影响，并且由于快速现代化和西方世界生活方式的采用，比率在全球中似乎有所增加。这些慢性病导致显著的发病率和死亡率，影响生活质量和预期寿命(M
’
Koma A.E.,World J Gastrointest Surg 2014；6(11),208
‑
219)。
[0004]在世界不同地区持续发现IBD发病率增加和社会经济发展相关的环境因素之间的关联，似乎发达国家的生活方式可能会削弱人类肠道微生物定殖的天然模式。在IBD中，粘膜损伤通常与对肠内共生微生物的免疫反应过度或失调有关，并且使用分子方法进行肠道微生物群分析的研究表明，肠微生物生态系统的微生态失调(即微生物群组成异常)和复杂性降低是CD或UC患者的共同特征(Manichanh et al.,Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.2012；9,599
–
608)。
[0005]根据基于16S rRNA基因分析的人肠道微生物群的多样性研究(Arumugam et al.Nature.2011；473:174
‑
180；Eckburg et al.Science.2005；308:1635
‑
1638；Hold et al.Appl Environ Microbiol.2003；69:4320
‑
4324；Schwiertz et al.J Pediatr.2010；157:240
‑
244；Suau et al.Systematic and Applied Microbiology.2001；24:139
‑
145；Walker et al.ISME J.2011:220
‑
230)，普氏栖粪杆菌(瘤胃球菌科)是在肠道中发现的三种最丰富的细菌物种之一，占健康个体的粪便微生物群中的2％
‑
20％。另一方面，据报道，
Environ Microbiol.2012；78:420
‑
428)。更具体地说，Lopez
‑
Siles等人(2012)基于16S rRNA基因序列分析了普氏栖粪杆菌分离株与梭菌群IV的其他成员之间的系统发育关系，并首次定义了普氏栖粪杆菌物种内的两个亲缘组(图1)，这些普氏栖粪杆菌亲缘组包括5个先前报道用于培养的分离株M21/2、ATCC 27766和ATCC 27768(属于PHGI)以及A2
‑
165和L2
‑
6(属于PHGII)的序列。
[0011]此外，Jia et al.(FEMS Microbiol Lett.2010；310:138
‑
144)描述了一种用于在单端点PCR中扩增属于普氏栖粪杆菌物种的细菌DNA序列的方法。分别针对普氏栖粪杆菌A2
‑
165和M21/2菌株的核苷酸转移酶基因和丁酰基
‑
CoA转移酶基因序列设计用于扩增的引物(Fp.ID.F2和Fp.ID.R2)，并且PCR产物的产出归类为属于两个不同的亚组，即A2
‑
165亚组和M21/2亚组(参见表1)。因此，用于扩增普氏栖粪杆菌成员的引物不靶向普氏栖粪杆菌16S rRNA基因，并且仅基于两种菌株的序列。此外，通过PCR产物的大小来区分属于每个亚组的成员，并且Jia et al.(2010)中没有公开A2
‑
165和M21/2亚组中的每一个亚组的特异性引物或探针。
[0012]目前，IBD的诊断要求全面体检和复查患者病史。包括验血、粪便检查、内镜检查、活检和影像学检查在内的各种检测有助于排除其他原因并确诊(World Gastroenterology Organisation Global Guidelines,Inflammatory bowel disease:a global perspective,June 2009)。
[0013]准确的IBD诊断对于提供基于证据的正确治疗是至关重要的，因为UC和CD患者中的治疗响应和并发症明显不同(Farmer et al.Am J Gastroenterol 2000；95:3184
‑
3188)。从临床医生的角度来看，这些疾病的准确诊断和分类将对患者辅导、评估疾病预后、监测疾病进展和复发，特别是为每种疾病亚型选择最适当的治疗具有潜在益处。此外，在基因型与表型的关联研究中，CD和UC的疾病进展问题是至关重要的，因为疾病表现和严重程度无疑会随着时间而改变(Satsangi et al.,Gut 2006；55,749
‑
753)。
[0014]尽管在过去的二十年，在IBD相关分子和血清学标志物的发现方面取得了重大进展，但仍需要改进的方法来进行准确诊断、分类、研究IBD和IBD表型的进展和/或预后。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于对对象肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度进行体外测定的方法；其中PHGI丰度测定包括使用具有序列SEQ ID NO：3或具有其至少75％一致性的序列的引物和/或探针；并且其中PHGII丰度测定包括使用具有序列SEQ ID NO：4或具有其至少75％一致性的序列的引物和/或探针。2.用于获得检测人类对象肠道疾病和/或预测药物在人类对象肠道疾病的治疗性治疗中的功效的有用信息的方法，所述方法包括根据权利要求1所述的方法测定PHGI和/或PHGII的丰度；其中所述肠道疾病选自炎症性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)和结肠直肠癌(CRC)。3.用于检测人类对象肠道疾病的方法，其包括以下步骤：a.根据权利要求1所述的方法测定所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；以及b.对所述对象样品中的PHGI和/或PHGII丰度和/或其数学组合、和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合与参考样品的对应值进行比较，其中上述对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示肠道疾病；其中所述肠道疾病选自炎症性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)和结肠直肠癌(CRC)；并且其中所述参考样品优选为健康对象样品和/或患有肠道疾病的缓解期患者的样品。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法为用于人类对象肠道疾病的筛查和/或诊断的方法，并且所述参考样品为健康对象样品和/或患有肠道疾病的缓解期患者的样品。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法为用于监测人类对象肠道疾病的活动和/或进展的方法，并且所述参考样品为同一对象的先前样品。6.用于预测对患有IBD的人类对象的治疗功效的方法，其中所述方法包括：a.根据权利要求1所述的方法测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；和b.比较对象样品的所述PHGI和/或PHGII丰度和/或其数学组合，和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度与参考样本的对应值，其中对象样品值相对于所述参考样品的显著偏差指示对治疗的响应可能性增加；并且其中所述参考样品优选为健康对象样品和/或患有肠道疾病的缓解期患者的样品。7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述肠道疾病为IBD，优选溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)，更优选CD。8.用于人类对象炎症性肠病(IBD)表型的鉴别诊断的方法，其包括以下步骤：a.根据权利要求1所述的方法测定来自所述对象的肠道样品中的普氏栖粪杆菌亲缘组I成员(PHGI)和/或普氏栖粪杆菌亲缘组II成员(PHGII)的丰度；和b.对对象样品中的PHGI和/或PHGII丰度和/或其数学组合、和/或可选地上述任一项与总普氏栖粪杆菌(FT)丰度和/或大肠杆菌(EC)丰度的数学组合，与要区分IBD表型的参考样品的对应值进行比较，以确定对象所患有的IBD表型；
其中呈现出与所述IBD表型之一显著相似的值的对象样品将指示所述对象患有所述IBD表型。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述IBD表型选自：
‑
CD表型，其由一个或更多个以下参数，优选所有以下参数定义：ο疾病部位；ο诊断年龄；和ο表现
‑
UC表型，其由一个或更多个以下参数，优选所有以下参数定义：ο疾病部位或扩展；以及ο严重性。10.根据权利要求8或9中任一项所述的方法，其特征在于，所述IBD表型选自：
‑
由回肠CD(I
‑
CD)、回结肠CD(IC
‑
CD)和结肠CD(C
‑
CD)组成的CD表型；和
‑
由溃疡性直肠炎(UC
‑
E1)、远端结肠炎(UC
‑
E2)和广泛性UC或全结肠炎(UC
‑
E3)组成的UC表型。11.根据权利要求8或9中任一项所述的方法，其特征在于，要区分的所述IBD表型为C
‑
CD与UC或C
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CD与UC
‑
E3。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，通过选自以下的分子方法进行PHGI和/或PHGII丰度测定，以及可选地进行FT和/或EC丰度定量：定量聚合酶链反应(qPCR)、PCR
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焦磷酸测序、荧光原位杂交(FISH)、微阵列和PCR
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ELISA，优选通过qPCR进行定量。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，用具有序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或与其具有至少75％一致性的序列的引物以及具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：米雷娅，
申请(专利权)人：赫罗纳约瑟夫特鲁塔博士生物医学研究基金会古德盖特公司，
类型：发明
国别省市：