一种基于CRISPR/Cas13a快速检测blaKPC基因的方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种基于CRISPR/Cas13a快速检测blaKPC基因的方法，具体公开了一种检测blaKPC基因的试剂，所述试剂包括检测blaKPC基因的crRNA和/或扩增blaKPC基因的引物对；所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列能够与Cas蛋白结合，所述向导序列与所述引物对的扩增产物序列相匹配。本发明专利技术提供的检测碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的试剂中的引物对可用于普通PCR技术、RPA等温扩增技术以检测快速、准确的检测碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因，其灵敏度高，特异性较强。特异性较强。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas13a快速检测blaKPC基因的方法


[0001]本专利技术属生物检测
，具体涉及一种基于CRISPR/Cas13a快速检测blaKPC基因的方法。

技术介绍

[0002]由于近年来碳青酶烯类抗生素的大量使用和滥用，这类被誉为革兰阴性杆菌最后一道防线的药物已面临破防的风险，碳青霉烯类耐药肠杆菌(Carbapenem
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Resistant Enterobacteriaceae，CRE)的出现和传播流行已成为全球抗感染面对的可怕对手，自2017年起CRE更被WTO列为21世纪最重要的耐药病原菌之一。其中，产生碳青霉烯酶是CRE最重要的耐药机制，根据Amber分类主要包括A、B、D三类酶，A类和D类同属丝氨酸酶，B类则是金属酶。据中国细菌耐药监测网2021年监测结果报告，我国临床分离CRE中碳青霉烯酶分布特征目前仍以KPC酶为主，而KPC酶属于碳青霉烯酶中的A类水解丝氨酸酶，细菌通过产KPC酶水解碳青霉烯类抗生素使其失去活性从而产生耐药性。由于CRE产生碳青霉烯酶类型不同，其对碳青霉烯类抗生素的作用方式和耐药程度也截然不同，由此临床对其治疗用药方向必须具有精确性和针对性。譬如对于产KPC水解酶和NDM金属酶这两种CRE，前者酶活性可被阿维巴坦抑制，产酶菌株通常仅对替加环素、多粘菌素或头孢他啶
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阿维巴坦敏感；后者酶活性不能被阿维巴坦抑制，产酶菌株通常仅对替加环素和多粘菌素敏感，少数菌株对氨曲南敏感。2020年发布的《肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识》也表明了发现CRE感染时，检测并报告了碳青霉烯酶对临床尽早尽快精准抗感染治疗具有重要的指导价值。
[0003]目前微生物实验室多采用药敏表型检测的方法指导抗菌药物使用，该方法结果直观但需要进行细菌分离培养。对于碳青霉烯酶常见的表型检测办法有Carba NP试验、改良碳青霉烯灭活试验(modified carbapenem inactivation method，mCIM)、EDTA碳青霉烯灭活试验(EDTA
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carbapenem inactivation method，eCIM)、碳青霉烯酶抑制剂增强试验，可以看到检测方法在不断进步优化虽易于检测，但只能初步鉴别碳青霉烯酶的产酶类型，无法明确耐药菌株的分子流行病学特征，更无法克服假阳性、假阴性和过夜培养耗时长的缺点。对于碳青霉烯酶常见的基因型检测方法主要包括荧光定量PCR和DNA测序等分子检测技术，虽然能大大缩短检测时长并直接检测碳青霉烯酶基因型，但其通常使用的试剂仪器费用高昂，对技术环境配置和操作人员要求也较高，较难普及至基层应用。近年来，核酸等温扩增技术越来越多应用于细菌的快速检测，由于其能在某一特定温度实现核酸的快速扩增，克服了传统PCR反应条件繁琐、检测时间长的缺点，在基层检测和即时检验方面都表现出巨大的优越性和便利性。环介导等温扩增(Loop
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mediated isothermal amplification，LAMP)技术需要2对引物，反应时间需40分钟左右，但60～65℃的温度条件使反应易产生气溶胶导致结果假阳性、加阴性率高。同为核酸等温扩增技术，重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术只需一对特异性引物，在37～40℃反应十数分钟便可实现指数式扩增。目前RPA技术的检测方式包括琼脂糖凝胶电泳和直接荧
光探针法。有大量研究包括本研究验证(图1)发现RPA产物通过琼脂糖凝胶电泳检测会出现拖带且电泳条带不清晰的现象，需经过纯化才能改善，无疑使操作更加繁琐。同时，一些低仪器配置地区实验室的病原微生物检测能力有限。多种因素迫切需要开发一种能大量投入应用于临床、操作简便、仪器试剂要求配置低、快速高效、灵敏特异的针对碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因新式检测技术。
[0004]成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 13a，CRISPR/Cas13a)是CRISPR/Cas蛋白家族新晋的一种核酸酶成员，近年来在扩展RNA干扰、基因编辑和分子诊断多个领域应用中备受青睐。与被熟知的Cas9需利用tracrRNA和crRNA结合切割DNA不同，Cas13a只需crRNA就可结合并切割RNA。Cas13a还具有附带切割效应，其HEPN结构域被crRNA识别并激活后，形成Cas13a
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crRNA
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靶RNA复合物，从而特异性水解靶RNA及非特异性水解周围RNA分子。研究可利用Cas13a这一特性，识别到靶RNA后对检测反应中加入的RNA荧光探针携带的淬灭基团进行非特异切割，实现荧光信号检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种检测blaKPC基因的试剂。
[0006]本专利技术第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。
[0007]本专利技术第三方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的试剂和/或本专利技术第二方面的试剂盒的应用。
[0008]本专利技术第四方面的目的，在于提供一种非疾病诊断的基于CRISPR/Cas13a的blaKPC基因的检测方法。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0010]本专利技术的第一个方面，提供一种检测blaKPC基因的试剂，所述试剂包括检测blaKPC基因的crRNA和/或扩增blaKPC基因的引物对；所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列能够与Cas蛋白结合，所述向导序列与所述引物对的扩增产物序列相匹配。
[0011]优选地，所述引物包括引物1、引物2和引物3中的至少一种；
[0012]KPC
‑
F1:5
’‑
CACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTCT
‑3’
(SEQ ID NO:1)；
[0013]KPC
‑
R1:5
’‑
AATTGGCGGCGGCGTTATCACTG TATTG
‑3’
(SEQ ID NO:2)；
[0014]所述引物2的序列为：
[0015]KPC
‑
F2:5
’‑
GTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
‑3’
(SEQ ID NO:3)；
[0016]KPC
‑
R2:5
’‑
CGGCGGCGTTATCACTGTATTG
‑3’
(SEQ ID NO:4)；
[0017]所述引物3的序列为：
[0018]KPC
‑
F3:5
’‑
CTTCAGCAACAAATTGGCGGCGGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测blaKPC基因的试剂，其特征在于，所述试剂包括检测blaKPC基因的crRNA和/或扩增blaKPC基因的引物对；所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列能够与Cas蛋白结合，所述向导序列与所述引物对的扩增产物序列相匹配。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述引物对包括引物1、引物2和引物3中的至少一种；所述引物1的序列为：KPC
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F1:5
’‑
CACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTCT
‑3’
(SEQ ID No.1)；KPC
‑
R1:5
’‑
AATTGGCGGCGGCGTTATCACTG TATTG
‑3’
(SEQ ID NO:2)；所述引物2的序列为：KPC
‑
F2:5
’‑
GTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
‑3’
(SEQ ID NO:3)；KPC
‑
R2:5
’‑
CGGCGGCGTTATCACTGTATTG
‑3’
(SEQ ID NO:4)；所述引物3的序列为：KPC
‑
F3:5
’‑
CTTCAGCAACAAATTGGCGGCGGCGTTATC
‑3’
(SEQ ID NO:5)；KPC
‑
R3:5
’‑
CCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTCTT
‑3’
(SEQ ID NO:6)；优选地，所述KPC
‑
R1和所述KPC
‑
R2包含T7启动子序列，所述T7启动子序列如SEQ ID NO:8所示；优选地，所述KPC
‑
F3包含T7启动子序列，所述T7启动子序列如SEQ ID NO:9所示。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述crRNA序列为5
’‑
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUCACCCAUCUCGGAAAAAUAUCUGACAAC
‑3’
(SEQ ID NO:7)优选地，所述锚定序列为5
’‑
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林海，梁铭君，陈丽丹，黄晓燕，肖斌，孙朝晖，
申请(专利权)人：中国人民解放军南部战区总医院，
类型：发明
国别省市：