一种干细胞外泌体在制备周围神经机械性损伤药物中的应用以及含有干细胞外泌体的药物制造技术

本发明专利技术涉及周围神经损伤修复技术领域。本发明专利技术提供了一种干细胞外泌体在制备周围神经机械性损伤药物中的应用以及含有干细胞外泌体的药物。本发明专利技术所用的干细胞具有来源丰富、取材容易以及增殖和分化能力强的特点，可用于“无细胞化”治疗。可以选择局部或/和全身应用干细胞来源外泌体治疗周围神经损伤，途径便捷。同时，本发明专利技术的外泌体与神经支架相容性好，显著增强周围神经再生效果。应用该干细胞外泌体治疗面神经损伤，可以减轻联带运动。可以减轻联带运动。可以减轻联带运动。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞外泌体在制备周围神经机械性损伤药物中的应用以及含有干细胞外泌体的药物


[0001]本专利技术涉及周围神经损伤修复
，尤其涉及一种干细胞外泌体在制备周围神经机械性损伤药物中的应用以及含有干细胞外泌体的药物。

技术介绍

[0002]周围神经机械性损伤是一种常见的临床疾病，有夹伤和缺损等类型，前者多采取保守治疗，后者则常采用自体神经移植。但是，周围神经再生能力有限，功能恢复往往难以令人满意；且自体神经移植存在供体组织的可获得性有限、供区失神经、神经瘤形成等缺点。所以，提高周围神经损伤修复的效果是棘手的临床难题之一。
[0003]成体间充质干细胞移植是目前治疗周围神经损伤中一种比较有前景的方法，在动物方面的实验结果令人鼓舞，部分已经成功应用于临床。但是干细胞分化后有潜在染色体变异和畸胎瘤形成的风险。而干细胞来源的外泌体能自由穿越血管壁、通过血脑屏障，且具有良好的稳定性，有利于储存及运输，可作为良好的非免疫原性药物载体，增加装载药物的生物利用度；干细胞来源外泌体比干细胞具有更好的细胞外基质结合能力，这让干细胞来源外泌体成为了神经组织损伤修复“无细胞”治疗的新型策略。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种毛囊表皮神经嵴干细胞外泌体在制备周围神经机械性损伤药物中的应用，可用于“无细胞化”治疗，可以选择局部或/和全身应用干细胞来源外泌体治疗周围神经损伤，途径便捷。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种干细胞外泌体在制备治疗周围神经机械性损伤药物中的应用。
[0007]作为优选，所述干细胞为毛囊表皮神经嵴干细胞、骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞中的一种或多种。
[0008]本专利技术还提供了一种治疗周围神经机械性损伤的药物。
[0009]作为优选，所述药物中还包括神经支架。
[0010]本专利技术提供了一种干细胞外泌体在制备周围神经机械性损伤药物中的应用以及含有干细胞外泌体的药物。本专利技术所用的干细胞具有来源丰富、取材容易以及增殖和分化能力强的特点，可用于“无细胞化”治疗。可以选择局部或/和全身应用干细胞来源外泌体治疗周围神经损伤，途径便捷。同时，本专利技术的外泌体与神经支架相容性好，显著增强周围神经再生效果。应用该干细胞外泌体治疗面神经损伤，可以减轻联带运动。
附图说明
[0011]图1为毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体的鉴定结果；
[0012]图2为雪旺细胞对大鼠毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体的内化图；
[0013]图3为背根神经节对大鼠毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体的内化图；
[0014]图4为毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体促进背根神经节神经元突起生长图；
[0015]图5为最适毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体浓度对雪旺细胞迁移能力及增殖的影响图；
[0016]图6为RT
‑
PCR分析毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体对雪旺细胞；BDNF、NGF的影响图；
[0017]图7为大鼠面神经损伤模型术后组织病理学检测结果；
[0018]图8为大鼠面神经损伤模型术后不同时间点大鼠行为学记录结果；
[0019]图9为大鼠面神经损伤模型术后复合肌肉动作电位记录检测结果；
[0020]图10为大鼠面神经损伤模型术后再生神经纤维的病理学检测结果。
具体实施方式
[0021]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0022]实施例1制备毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体流程
[0023]收集毛囊表皮神经嵴干细胞培养上清液置于离心管中，待细胞融合至70％时，用无菌PBS冲洗三次，并更换无血清的培养液进行培养；孵育48小时后，收集细胞上清液离心分装；随后4℃300
×
g离心10分钟，将上清转移至新的离心管中，再次4℃800
×
g离心15分钟，随后转移上清至新的离心管中，10000
×
g离心30分钟除去细胞碎片，上清转移至新的离心管中，最后再4℃120000
×
g离心70分钟，得到的沉淀就是外泌体。
[0024]实施例2毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体的鉴定
[0025](1)透射电镜观察外泌体形态，显示外泌体呈杯状，圆形或椭圆形；
[0026](2)纳米颗粒示踪分析(nanoparticletrackinganalysis,NTA)检测外泌体粒径，显示外泌体粒径主要在80～200纳米之间；
[0027](3)Westernblot分析鉴定外泌体标志(ALIX、CD63、TSG101)的表达情况。
[0028]结果如图1所示：其中左图为WesternBlot检测结果，中图为透射电镜检测结果，右图为NTA检测结果。
[0029]实施例3毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体在周围神经损伤中的局部应用
[0030]神经夹伤处局部即刻注射外泌体，浓度为60μg/ml，注射量5μl，以神经夹伤段的神经外膜充盈为宜。
[0031]神经缺损修复时，体外预先将外泌体注射入支架内，浓度为60μg/ml，注射量15μl，以神经缺损段的支架(包括生物支架和人工材料)充盈为宜。随即行神经缺损的桥接修复。
[0032]实施例4毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体在周围神经损伤中的全身应用
[0033]高位周围神经损伤，局部应用外泌体联合静脉注射外泌体。局部应用外泌体的浓度、注射量见第3条；静脉注射外泌体，浓度为60μg/ml，注射量每天200μl，疗程10天。
[0034]实施例5雪旺细胞或者背根神经节对大鼠毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体的内化
[0035]取大鼠毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体与2μlPKH26染料，分别加入0.25mlDiluentC中，将二者合并混匀后常温避光孵育4min。混合液转移到离心管中，加入完
全培养基中止染色，100000g离心70min清除多余染料，沉淀部分即为标记完成的外泌体。将雪旺细胞或者背根神经节接种到腔室载玻片中，加入标记后的外泌体培养18h后，4％多聚甲醛固定10min，进行DAPI细胞核染色、封片后采用激光共聚焦法观察外泌体内化情况结果如图2和图3所示。
[0036]实施例6毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体促进背根神经节神经元突起生长
[0037]培养的背根神经节神经元分为三组：背根神经节(DRG)组、背根神经节(DRG)+PBS溶液组、背根神经节(DRG)+毛囊表皮神经嵴干细胞来源外泌体(EPI
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NCSCs
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Exos，1
×
107/ml)三组，每组设3个副孔。培养第48小时，各组分别加入相应的液体，然后继续培养48小时。激光共聚焦显微镜下观察、比较各组神经元突起长度、数量以及每个神经元发出分支的数量、髓鞘厚度，结果如图4所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞外泌体在制备治疗周围神经机械性损伤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述干细胞为毛囊表皮神经嵴干细胞、骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱国臣，潘瑶，唐笠，徐梦洁，
申请(专利权)人：无锡市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：