酯化虾青素的制造方法及酯化基因的应用技术

本公开提供了一种酯化虾青素的制造方法及酯化基因的应用，属于生物工程技术领域。所述制造方法包括：获取酯化基因，且所述酯化基因形成的蛋白与CzDGAT2C蛋白或者CzDGAT2D蛋白的同源性高于90％，所述CzDGAT2C蛋白通过佐芬根色绿球藻的二酰基甘油酰基转移酶基因Czdgat2c形成，所述CzDGAT2D蛋白通过佐芬根色绿球藻的二酰基甘油酰基转移酶基因Czdgat2c形成；采用所述酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体；将所述表达载体转化至产游离虾青素的菌株中，得到酯化虾青素。本公开通过该酯化虾青素的制造方法，可以制得酯化虾青素。可以制得酯化虾青素。可以制得酯化虾青素。

【技术实现步骤摘要】
酯化虾青素的制造方法及酯化基因的应用


[0001]本公开属于生物工程
，特别涉及一种酯化虾青素的制造方法及酯化基因的应用。

技术介绍

[0002]虾青素(astaxanthin)是一种天然红色的酮基类胡萝卡素。虾青素的天然存在形式包括游离虾青素、酯化虾青素、糖基化虾青素等。酯化虾青素相较于游离虾青素，稳定性更好，且有文献表明二者生物活性有差异。目前酯化虾青素主要通过雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)发酵获得。将雨生红球藻置于培养基中，并将培养基置于光照条件下。当积累一定生物量后转为缺氮等压力培养方式，使得雨生红球藻细胞内的虾青素迅速积累且大部分以酯化虾青素的方式积累，再通过浸提，过滤等提取酯化虾青素。然而，通过以上方法形成酯化虾青素时，合成周期长、效率低，酯化虾青素的发酵成本高限制其广泛应用。此外，尽管雨生红球藻是酯化虾青素的最主要来源，但迄今为止，雨生红球藻中负责酯化虾青素合成的基因尚未被解析。
[0003]早在1994年，佐芬根色绿球藻(Chromochloris zofingiensis)被发现能产生虾青素，此后Liu等人提出佐芬根色绿球藻有替代雨生红球藻的潜力。和雨生红球藻类似，佐芬根色绿球藻的虾青素主要以单酯和二酯的形式存在，说明其含有能够高效催化游离虾青素转化为酯化虾青素的基因。佐芬根色绿球藻和雨生红球藻是近缘绿藻，与后者相比佐芬根色绿球藻不仅能利用光能和CO2进行光自养生长，还能利用有机碳源生长，因此可以在异养条件下进行培养。佐芬根色绿球藻在发酵过程中干细胞重量可达98.4g L
‑1，远远高于光自养条件下的干细胞重量。在最新的研究中，采用两阶段的异养培养过程，使佐芬根色绿球藻虾青素产量达到0.318g L
‑1，其中生物量产量为235.4g L
‑1，虾青素含量为干重的0.144％。同时，总脂肪酸含量占干重的比例由23％提高到42％。
[0004]β
‑
胡萝卜素羟化酶(CrtZ)和β
‑
胡萝卜素酮化酶(CrtW)是雨生红球藻和佐芬根色绿球藻中游离虾青素合成的两个关键蛋白，但不同来源的CrtZ和CrtW具有不同的底物偏好性。在雨生红球藻中CrtW以β
‑
胡萝卜素为底物起始催化反应，而在佐芬根色绿球藻中CrtZ起始催化底物β
‑
胡萝卜素。尽管二者最终都是以积累酯化虾青素为主，但是催化游离虾青素合成酯化虾青素的基因一直未被解析。
[0005]对于酯化基因的探究一直在进行中，在雨生红球藻中，Chen等人提出二酰基甘油酰基转移酶基因(DGAT)可能是酯化虾青素的关键基因，并提取雨生红球藻的内质网区进行了体外酶活实验分析，但没有得到准确的结果，DGAT抑制剂并不能完全抑制虾青素酯的产生。在佐芬根色绿球藻中，Liu等人也同样研究了佐芬根色绿球藻的酯化基因，其在转录组分析中同样发现，在虾青素增加时，DGAT的表达上调。但在可合成游离虾青素的大肠杆菌工程菌中异源表达不同佐芬根色绿球藻来源dgat后，均未检测到酯化虾青素，因此认为可能是其他的未发现的酰基转移酶类催化这一过程。

技术实现思路

[0006]本公开实施例提供了一种酯化虾青素的制造方法及酯化基因的应用，可以辅助产游离虾青素的工程菌株，获取得到酯化虾青素。所述技术方案如下：
[0007]本公开实施例提供了一种酯化虾青素的制造方法，所述制造方法包括：获取酯化基因，且所述酯化基因形成的蛋白与CzDGAT2C蛋白或者CzDGAT2D蛋白的同源性高于90％，所述CzDGAT2C蛋白通过佐芬根色绿球藻的二酰基甘油酰基转移酶基因Czdgat2c形成，所述CzDGAT2D蛋白通过佐芬根色绿球藻的二酰基甘油酰基转移酶基因Czdgat2c形成；采用所述酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体；将所述表达载体转化至产游离虾青素的菌株中，得到酯化虾青素。
[0008]本公开的又一种实现方式中，所述获取酯化基因，包括：
[0009]获取所述佐芬根色绿球藻的多个dgat2基因；从所述dgat2基因中，获取Czdgat2c基因或者Czdgat2d基因中的至少一种，作为所述酯化基因。
[0010]本公开的又一种实现方式中，采用所述酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体，包括：
[0011]对所述酯化基因进行密码子优化；将优化后的所述酯化基因克隆到pYLXP
’
2线性载体，得到表达载体，所述表达载体为pYLXP
’
2::Czdgat2c载体或者pYLXP
’
2::Czdgat2d载体。
[0012]本公开的又一种实现方式中，所述将优化后的所述酯化基因克隆到pYLXP
’
2线性载体，包括：
[0013]将所述pYLXP
’
2载体进行双酶切，得到多个线性化的pYLXP
’
2载体片段，各所述线性化的pYLXP
’
2载体片段具有粘性末端；通过凝胶电泳对多个所述线性化的pYLXP
’
2载体片段进行分离，并用DNA凝胶回收试验盒对多个所述线性化的pYLXP
’
2载体片段中的目的载体片段进行回收，得到pYLXP
’
2线性化载体片段；将所述pYLXP
’
2线性化载体片段和优化后的所述酯化基因通过连接酶进行连接，使得优化后的所述酯化基因克隆到所述pYLXP
’
2线性化载体片段上。
[0014]本公开的又一种实现方式中，所述将所述表达载体转化至产游离虾青素的工程菌株中，得到酯化虾青素，包括：
[0015]对所述产游离虾青素的菌株进行活化处理；将所述表达载体转入在活化处理后的所述产游离虾青素的菌株中进行培养，得到培养液；对所述培养液进行处理，得到所述酯化虾青素。
[0016]本公开的又一种实现方式中，所述将所述表达载体转入在活化处理后的所述产游离虾青素的菌株中进行培养，得到培养液，包括：
[0017]将活化处理后的所述产游离虾青素的菌株的菌液涂抹在培养基平板上进行培养，得到底盘菌株；将所述表达载体转入所述底盘菌株中进行培养，得到所述培养液。
[0018]本公开的又一种实现方式中，所述将活化处理后的所述产游离虾青素的菌株的菌液涂抹在培养基平板上进行培养，得到底盘菌株，包括：
[0019]将活化24
‑
36h后的所述产游离虾青素的菌株的菌液涂于固体培养基，并在28
‑
30℃条件下静置培养48h；在所述固体培养基平板挑取出产游离虾青素含量最高的菌株，作为所述底盘菌株。
[0020]本公开的又一种实现方式中，所述对所述培养液进行处理，得到所述酯化虾青素，包括：
[0021]将所述培养液分离，得到提取液；对所述提取液进行薄层色谱法分离和液相色谱检测，得到所述酯化虾青素。
[0022]本公开的又一种实现方式中，所述产游离虾青素的菌株本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酯化虾青素的制造方法，其特征在于，所述制造方法包括：获取酯化基因，且所述酯化基因形成的蛋白与CzDGAT2C蛋白或者CzDGAT2D蛋白的同源性高于90％，所述CzDGAT2C蛋白通过佐芬根色绿球藻的二酰基甘油酰基转移酶基因Czdgat2c形成，所述CzDGAT2D蛋白通过佐芬根色绿球藻的二酰基甘油酰基转移酶基因Czdgat2c形成；采用所述酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体；将所述表达载体转化至产游离虾青素的菌株中，得到酯化虾青素。2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述获取酯化基因，包括：获取所述佐芬根色绿球藻的多个dgat2基因；从所述dgat2基因中，获取Czdgat2c基因或者Czdgat2d基因中的至少一种，作为所述酯化基因。3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于，采用所述酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体，包括：对所述酯化基因进行密码子优化；将优化后的所述酯化基因克隆到pYLXP
’
2线性载体，得到表达载体，所述表达载体为pYLXP
’
2::Czdgat2c载体、pYLXP
’
2::Czdgat2d载体或者pYLXP
’
2::Czdgat2c
‑
Czdgat2d载体。4.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于，所述将优化后的所述酯化基因克隆到pYLXP
’
2线性载体，包括：将所述pYLXP
’
2载体进行双酶切，得到多个线性化的pYLXP
’
2载体片段，各所述线性化的pYLXP
’
2载体片段具有粘性末端；通过凝胶电泳对多个所述线性化的pYLXP
’
2载体片段进行分离，并用DNA凝胶回收试验盒对多个所述线性化的pYLXP
’
2载体片段中的目的载体片段进行回收，得到pYLXP
’
2线性化载体片段；将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：万霞，吴俊杰，黄凤洪，龚阳敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：