一种产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母制造技术

本发明专利技术公开了一种产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母，属于代谢工程领域。所述方法包括：槐糖脂代谢途径改造；启动子工程条件关键酶的表达强度；高产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母的构建；菌株的发酵；酸型槐糖脂的提取分离与鉴定。本发明专利技术构建得到的重组熊蜂生假丝酵母发酵油酸能够合成单一的酸型槐糖脂，而不再合成内酯型槐糖脂，同时酸型槐糖脂的产量由20g

【技术实现步骤摘要】
一种产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母


[0001]本专利技术涉及一种产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母，属于代谢工程领域。

技术介绍

[0002]槐糖脂是一类由两个葡萄糖基和一个脂肪酸链组成的两亲性化合物，因其具有良好的起泡性、溶解性，乳化性及抑菌性等特性而被广泛应用。假丝酵母菌可以利用糖和植物油等为碳源，经一定条件的发酵工艺合成槐糖脂，生产过程绿色，对环境友好。熊蜂生假丝酵母(Starmerellabombicola)作为单倍体非常规酵母，是目前槐糖脂高产菌株之一，其野生型菌株主要以脂肪酸和葡萄糖作为底物，代谢合成槐糖脂。然而，野生型菌株生产的槐糖脂为酸型及内酯型混合物，两种槐糖脂拥有不同的结构、生物活性、理化性质及应用领域，如在抑菌及抗癌方面，内酯型槐糖脂具有更好的功效，而酸型槐糖脂则在精子固定和抗病毒方面具有显著的优势。当前想要获得单一组分的槐糖脂用于特定领域比较困难，因此，通过基因遗传操作，对现有野生菌株进行改造从而有目的地提高某一种特异性槐糖脂的产量将显得尤为重要。
[0003]以葡萄糖和植物油为底物发酵生产酸型槐糖脂时，其合成代谢主要过程为：脂肪酸在细胞色素氧化酶CYP52M1的催化下进行ω
‑
氧化产生ω或ω
‑
1羟基脂肪酸，接着在葡萄糖基转移酶UGTA1的催化下，将UDP
‑
葡萄糖转移至羟基脂肪酸的羟基位置形成葡萄糖酯；再在葡萄糖基转移酶UGTB1的催化下，添加另一个葡萄糖基形成酸型槐糖脂(非乙酰化)。该酸型槐糖脂可进一步在酰基化酶AT的作用下形成，单乙酰或双乙酰酸型槐糖脂，再在multidrug resistance protein蛋白作用下转移至胞外，最后经内酯化酶SBLE催化，形成含有不同取代基的内酯型槐糖脂(图1)。目前微生物生产槐糖脂还存在一些问题，第一点，野生型菌株的产物为酸型及内酯型混合物，且发酵批次的不同可能导致产品中酸型及内酯型的比例也有很大差异，纯度难以保证，这也限制了其应用范围；第二点，槐糖脂产量受发酵原料影响很大，已报道的高产条件所使用的原料成本高，如Pekin报导的使用蜂蜜和玉米油作为发酵原料可获得400g/L的产量(Pekin G,Vardar
‑
Sukan F,Kosaric N.Production of sophorolipids from Candida bombicola ATCC 22214using Turkish corn oil and honey[J].Engineering in Life Sciences,2005,5(4):357
‑
362.)；第三点，熊蜂生假丝酵母为非模式菌株，没有高效基因编辑方法，很难通过代谢工程改造获得重组菌株。

技术实现思路

[0004]为了获得单一的酸型槐糖脂，构建了潮霉素基因重复利用系统，利用该系统，我们将合成内酯型槐糖脂的关键基因—内酯酶基因SBLE敲除获得一株只产酸型槐糖脂的工程菌株Sb
‑
3，进一步敲除过氧化物酶体膜转运蛋白编码基因PXA1，并在此位点整合表达了CYP52M1，CPR及潮霉素抗性基因(hph)，从而构建了高产酸型槐糖脂的酵母工程菌。
[0005]本专利技术提供了一种构建重组熊蜂生假丝酵母的方法，敲除熊蜂生假丝酵母基因组中合成内酯型槐糖脂的关键基因—内酯酶基因SBLE。
[0006]在一种实施方式中，敲除过氧化物酶体膜转运蛋白编码基因PXA1。
[0007]在一种实施方式中，在PXA1位点整合表达了CYP52M1。
[0008]在一种实施方式中，在PXA1位点整合表达了CPR。
[0009]在一种实施方式中，在PXA1位点整合表达了潮霉素抗性基因hph。
[0010]在一种实施方式中，所述熊蜂生假丝酵母为熊蜂生假丝酵母ATCC22214。
[0011]本专利技术提供了所述方法制备得到的重组熊蜂生假丝酵母。
[0012]本专利技术提供了一种生产油酸的方法，利用所述重组熊蜂生假丝酵母发酵生产油酸。
[0013]在一种实施方式中，将所述重组熊蜂生假丝酵母经50mL YPD培养基培养过夜，以5％的接种量转接至含有发酵培养基的5L发酵罐中培养。
[0014]在一种实施方式中，在发酵罐中培养24h时加入油酸继续发酵。
[0015]有益效果：本专利技术构建得到的重组熊蜂生假丝酵母与出发菌株相比，重组熊蜂生假丝酵母发酵油酸能够合成单一的酸型槐糖脂，而不再合成内酯型槐糖脂，同时酸型槐糖脂的产量由20g
·
L
‑1提高到44g
·
L
‑1。该菌株经5L发酵罐发酵，酸型槐糖脂产量可达99.5g
·
L
‑1。
附图说明
[0016]图1为槐糖脂代谢合成途径示意图；
[0017]图2为重组菌株摇瓶发酵培养酸型槐糖脂产量测定；
[0018]图3为重组菌株5L发酵罐发酵培养的生长情况；
[0019]图4为重组菌株5L发酵罐发酵培养酸型槐糖脂产量测定；
[0020]图5为酸型槐糖脂的纯化与质谱鉴定。
具体实施方式
[0021]表1扩增基因所使用的引物
[0022][0023]实施例1：产酸型槐糖脂的重组熊蜂生假丝酵母的构建
[0024]如图1，酸型槐糖脂可以在内酯酶的作用下，生成内酯型槐糖脂。由于脂肪酸代谢过程中涉及到氧化还原反应，因此细胞内需要较高的氧化还原水平。有研究证明在槐糖脂合成过程，敲除CYP52M1基因该菌株无法继续生产槐糖脂。因此，通过在敲除内酯化酶基因(SBLE)的同时，提高细胞色素P450氧化酶基因(CYP52M1)及细胞色素P450氧化还原酶基因)CPR)的表达水平，来探究对该菌株产槐糖脂的影响。最终得到了一株在SBLE基因位点整合表达SbCas9基因，且同时在PXA1位点表达CYP52M1，CPR及潮霉素抗性基因(hph)的重组菌株
Sb
‑
3。
[0025]实施例2：重组熊蜂生假丝酵母的发酵生产
[0026]对重组菌株Sb
‑
3进行5L发酵罐培养，测定生产酸型槐糖脂的能力。菌株经50mL YPD培养基培养过夜，以5％的接种量转接至含有发酵培养基的5L发酵罐中，发酵液总体积为3L，培养24h之后加入油酸。从图2可以看出，菌株在72h时即可进入稳定生长期，菌体浓度(OD
600
)可达到220左右，相比于摇瓶水平提高了37.5％。从葡萄糖消耗速率来看，培养到84h时，葡萄糖已全部耗完。此外，在菌体生长的前期，随着菌体的生长，发酵液的pH值从初始6.0降到2.8左右，通过添加氨水调节pH稳定在3.5
‑
4.0之间。培养7d后，结束发酵，最终测得酸型槐糖脂在发酵第6d时产量最高，可达99.5g
·
L
‑1(图3)。
[0027]实施例3：酸型槐糖脂的分离纯化
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建重组熊蜂生假丝酵母的方法，其特征在于，敲除熊蜂生假丝酵母基因组中合成内酯型槐糖脂的关键基因—内酯酶基因SBLE。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，敲除过氧化物酶体膜转运蛋白编码基因PXA1。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在PXA1位点整合表达了CYP52M1。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在PXA1位点整合表达了CPR。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在PXA1位点整合表达了潮霉素抗性基因hph。6.根据权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈献忠，夏媛媛，杨海泉，石依博，张疆睿，沈微，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：