一种合成24-表麦角固醇真菌的构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种合成24

【技术实现步骤摘要】
一种合成24
‑
表麦角固醇真菌的构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种合成24
‑
表麦角固醇真菌的构建方法与应用，本专利技术在真菌中，通过基因编辑，获得了产24
‑
表麦角固醇的重组真菌菌株，涉及合成生物学
以及酶工程领域。

技术介绍

[0002]油菜素内酯类化合物(Brassinosteroids，BRs)是一类在植物中具有高生理活性的天然类固醇内酯/酮物质，被认为是第六类植物激素。其在种子萌发、根系生长、繁殖等植物生长过程中起着至关重要的作用；同时，能够与其他植物激素相协调，调节植物氧化自由基的代谢、乙烯合成和根向重力反应，提高植物对如干旱、高盐、极端温度等苛刻环境的抗逆性。作为BRs中生物活性最高的化合物，油菜素内酯(Brassinolide，BL，又称芸苔素内酯)(图1)具有巨大的农业和工业应用潜力。
[0003]然而，由于油菜素内酯在植物中含量极少，即使在含量较高的花粉与种子中，含量仅仅是在1
‑
100ng/g(鲜重)，远远不能满足研究以及农业本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成24
‑
表麦角固醇真菌的构建方法，其特征在于，将甾醇Δ
24(28)
还原酶DWF1或DWF1突变体基因重组表达到产麦角固醇的真菌体内，构建得到合成24
‑
表麦角固醇的菌株。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述产麦角固醇的真菌是产麦角固醇的真核微生物或其敲除了ERG4基因的突变体，优选的是酵母科(Saccharomycetaceae)、菌核菌科(Sclerotiniaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、肉座菌科(Hypocreaceae)、发菌科(Trichocomaceae)、曲霉菌科(Aspergillaceae)、白蘑科(Tricholomataceae)真核微生物或上述真核微生物的ERG4基因敲除的突变体，特别优选的是敲除ERG4基因的酿酒酵母。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的DWF1突变体基因的获得方式包括如下步骤：以植物来源的甾醇Δ
24(28)
还原酶DWF1基因为模板，在0.02
‑
0.12mM Mn
2+
下进行易错PCR，构建DWF1突变体文库；将DWF1突变体文库与线性化质粒pRS42H共转化ERG4敲除的产麦角固醇的真菌菌株，涂布在含有50
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200μg/mL Hyg B的固体培养基上；将生长的菌株挑取至含有50
‑
200μg/mL Hyg B以及ERG4敲除菌株生长抑制剂的培养基中培养；挑取能够生长的菌株，接种至含有50
‑
200μg/mL Hyg B的培养基中培养，对培养得到的菌体进行皂化处理、萃取并液相分析，筛选出酶活提高的菌株；提取酶活提高菌株的质粒，对质粒进行测序分析，从而得到催化活性提高的DWF1突变体序列。4.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于，所述的甾醇Δ
24(28)
还原酶DWF1基因来源于产油菜素内酯类化合物的植物，优选的是...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建平，蒋亦琪，朱力，孙志娇，薛海龙，吴绵斌，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：