视网膜神经节细胞的再生制造技术

本文提供了用于通过激活转录因子如Atoh7、Brn3B、Sox4、Sox11或Ils1中的一种或多种从视网膜神经元细胞再生视网膜神经节细胞(RGC)的组合物和方法。视网膜神经元细胞可以是中间神经元细胞，例如无长突细胞、水平细胞和双极细胞。再生的RGC可以将轴突投射到离散的皮层下脑区并建立视网膜

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】视网膜神经节细胞的再生
[0001]本专利技术要求2020年1月16日提交的202010047628.2的优先权，其内容整体纳入本文。

技术介绍

[0002]视网膜神经节细胞(RGC)是视网膜的最终输出神经元，其处理视觉信息并将其传输到离散的大脑视觉区域以形成视觉。RGC的缺失是一组被广泛归类为视神经病变的疾病中失明的主要原因，这些疾病包括青光眼、遗传性视神经病变以及由毒素、营养缺陷和创伤引起的疾病。这些患者的视力丧失是不可逆转的，因为人类和所有哺乳动物都缺乏在成年期产生RGC的能力。人们对开发再生疗法以恢复此类患者的视力丧失非常感兴趣。
[0003]开发用于视神经病变的再生疗法的一种有吸引力的方法是替换丢失的神经节细胞并使用内源性细胞将视网膜重新连接到大脑。已经做出了巨大的努力来识别视网膜干/祖细胞并了解视网膜神经元是如何在各种模式生物中产生的。先前的研究表明，鱼类和两栖动物等低等脊椎动物在受伤后会在功能上再生其视网膜，而穆勒神经胶质(M
ü
ller glia)是再生视网膜神经元的细胞来源。相比之下，哺乳动物中的穆勒神经胶质(M
ü
ller glia)没有这种能力，包括人类在内的哺乳动物也没有其他视网膜干/祖细胞库，可以在成年阶段再生视网膜神经元。目前的共识是，在成熟的哺乳动物视网膜中通常几乎没有持续添加神经元。
[0004]迫切需要治疗这些疾病和病症并恢复患者的视力。

技术实现思路

[0005]本公开报道了视网膜神经节细胞(RGC)可以通过激活转录因子例如Atoh7、Brn3B、Sox4、Sox11或Ils1中的一种或多种从视网膜神经元再生的发现。再生的RGC可以将轴突投射到离散的皮层下脑区并建立视网膜
‑
大脑连接。它们可以对视觉刺激做出反应并将电信号传输到大脑中。因此，再生的RGC可以替代受损或退化的RGC，从而治疗视力障碍或失明。
[0006]在另一个意想不到的发现中，这些转录因子的激活也可以重新激活退化、受损或老化的RGC，使它们能够再生功能性轴突。因此，当向受试者施用可以激活这些转录因子的治疗剂时，它们可以使退化、受损或老化的RGC恢复活力，同时将附近的中间神经元细胞重编程为再生的RGC。这些试剂的这种双重作用可以更有效地实现所需的治疗效果。
[0007]根据本公开的一个实施方案，提供了一种制备对视觉信号有反应的哺乳动物细胞的方法，包括增加视网膜神经元细胞的一种或多种选自由以下组成的组的基因的生物学活性：POU 4类同源框2(Brn3B)、SRY框转录因子4(Sox4)、Atonal BHLH转录因子7(Atoh7)、SRY框转录因子11(Sox11)和ISL LIM同源框1(Ils1)。
[0008]在一些实施方案中，所述一种或多种基因包含Brn3B和Sox4。在一些实施方案中，所述一种或多种基因进一步包含Atoh7。
[0009]在一些实施方案中，视网膜神经元细胞是中间神经元细胞，例如无长突细胞、水平细胞或双极细胞。在一些实施方案中，视网膜神经元细胞是退化的、受损的或老化的视网膜
神经节细胞(RGC)。在一些实施方案中，视网膜神经元细胞是Lgr5
+
无长突细胞。在一些实施方案中，视网膜神经元细胞是Prokr2
+
置换的无长突细胞。
[0010]在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于改善视网膜神经节细胞(RGC)功能的方法，该视网膜神经节细胞可以是退化的、受损的、老化的或正常的/健康的，其需要改善的功能。在一些实施方案中，该方法需要在RGC中增加一种或多种选自由Atoh7、Brn3B、Sox4、Sox11和Ils1组成的组的基因的生物学活性。
[0011]在一些实施方案中，增加一种或多种基因的生物学活性包括向视网膜神经元细胞中引入一种或多种编码基因的多核苷酸，例如cDNA，其可以在质粒或病毒载体中提供，例如腺相关的病毒(AAV)载体。
[0012]还提供了一种用于治疗有需要的受试者的视力障碍或失明的方法，包括向受试者的视网膜施用能够增加一种或多种选自由Brn3B、Sox4、Atoh7、Sox11和Ils1组成的组的基因的生物学活性的试剂。
[0013]在一些实施方案中，视力障碍或失明是由退化的视网膜神经节细胞(RGC)引起的。在一些实施方案中，视力障碍或失明与选自由视神经病(包括青光眼)、遗传性视神经病和由毒素、营养缺陷和外伤引起的病症组成的组的病况相关。
[0014]在一个实施方案中，还提供了一种核酸构建体，其包含编码Brn3B和Sox4蛋白的编码序列，以及与每个编码序列相关的启动子，其中每个启动子在视网膜神经元细胞中是有活性的。
[0015]另一个实施方案提供了由核酸构建体转染的细胞。又一个实施方案提供了一种对视觉信号有反应的细胞，其通过本文公开的方法制备。
[0016]这些和其他实施方案在下文中进一步描述。
附图说明
[0017]图1.Lgr5
+
无长突中间神经元在成年小鼠中转分化为其他神经元亚型。a，视网膜横截面图像，其显示内核层中的Lgr5
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无长突中间神经元。b，c，来自Lgr5
EGFP
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IRES
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CreERT2
；Rosa26
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tdTomato小鼠的视网膜横截面图像。箭头突出显示来自Lgr5
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无长突中间神经元的双极(b)和水平(c)细胞的生成。d，视网膜平铺(flat
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mount retina)样本的图像，聚焦在视网膜神经节细胞层上。从内核层迁移到神经节细胞层的Lgr5
+
无长突中间神经元被标记为绿色。e，Lgr5
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无长突细胞响应全场闪光的代表性膜电位。插图：染料填充后记录的细胞的荧光图像。f，Lgr5
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无长突细胞响应全场闪光的代表性兴奋性突触后电流(EPSC，蓝色)和抑制性突触后电流(IPSC，红色)。总6个记录的细胞中共有5个对全场LED光刺激有反应。图e和f中的箭头：刺激伪影。ONL：外核层；OPL：外丛状层；INL：内核层；IPL：内丛状层；GCL：神经节细胞层。比例尺，图a、b和c中＝30μm，图d中＝200μm，图e中＝10μm。
[0018]图2.在体内将Lgr5
+
无长突中间神经元重编程为RGC。a，体内神经元重编程的策略。首先给Lgr5
EGFP
‑
IRES
‑
CreERT2
；Rosa26
‑
tdTomato小鼠喂食他莫昔芬(TM)五次(从第
‑
11天(D
‑
11)到第
‑
7天(D
‑
7))，用Rosa26
‑
tdTomato报告基因标记Lgr5
+
无长突中间神经元，以协助身份追踪。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.制备对视觉信号有反应的哺乳动物细胞的方法，其包括增加视网膜神经元细胞中一个或多个选自由以下组成的组的基因的生物学活性：POU 4类同源框2(Brn3B)SRY
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box转录因子4(Sox4)Atonal BHLH转录因子7(Atoh7)，SRY
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Box转录因子11(Sox11)，和ISL LIM同源框1(Ils1)。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种基因包括Brn3B和Sox4。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种基因进一步包括Atoh7。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中，所述视网膜神经元细胞是选自由无长突细胞、水平细胞和双极细胞组成的组的视网膜中间神经元细胞，或者是退化、损伤或老化的视网膜神经节细胞(RGC)。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中，所述视网膜神经元细胞是Lgr5
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无长突细胞。6.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中，所述视网膜神经元细胞是Prokr2
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置换的无长突细胞。7.改善视网膜神经节细胞(RGC)功能的方法，包括增加RGC中一个或多个选自由Atoh7、Brn3B、Sox4、Sox11和Ils1组成的组的基因的生物学活性。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述RGC是退化的、受损的、老化的或正常的视网膜神经节细胞(RGC)。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中增加所述一种或多种基因的生物学活性包括向所述视网膜神经元细胞中引入编码所述基因的一种或多种多核苷酸。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸是cDNA。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸在质粒或病毒载体中提供。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。13.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸是mRNA。14.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中增加所述基因的生物学活性包括将相应的蛋白质引入视网膜神经元细胞。15.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中增加所述基因的生物学活性包括激活所述内源基因在所述视网膜神经元细胞中的表达。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中，所述视网膜神经元细胞存在于患有视力障碍的受试者体内。17.根据权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中，所述视网膜神经元细胞是体外的。18.根据权利要求17所述的方法，还包括将制备的对视觉信号有反应的哺乳动物细胞植入患有视力...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洪军，未小虎，乔娜，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：