含有U6启动子的流感病毒报告质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及含有U6启动子的流感病毒报告质粒及其构建方法和应用，属于报告质粒构建领域。该报告质粒包括U6启动子序列和功能目的片段，所述功能目的片段包括IAV基因的3

【技术实现步骤摘要】
含有U6启动子的流感病毒报告质粒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及含有U6启动子的流感病毒报告质粒及其构建方法和应用，属于报告质粒构建领域。

技术介绍

[0002]GFP，即绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)。eGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein,增强型绿色荧光蛋白)是GFP突变系，应用较多的是GFP的突变体(64位苯丙氨酸
→
亮氨酸变异)，发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。
[0003]NanoLuc萤光素酶(Nluc)，是一个经过基因工程改造的小分子酶(19.1kDa)，它是目前性能最好的生物发光报告基因之一。该酶比萤火虫(Photinus pyralis)或海肾(Renilla reniformis)萤光素酶的发光亮100倍，它使用一种新型底物——furimazine，可产生高强度发光。生物发光反应不依赖ATP，同时抑制背景发光以获得最高检测灵敏度。
[0004]载体质粒MLM3636是一段质粒载体，可通过Addgene官网上下载并购买。
[0005]目前常规检分离病毒与检测流感病毒复制的手段有噬斑试验，TCID50检测等，然而这些方法对实验操作要求高，耗时长(常规需要3
‑
4天)，判读结果存在一定的主观性。
[0006]当前，主要采用报告病毒(示踪病毒)实现细胞成像或活体动物成像，来实现高效实时评价病毒增殖过程。这类报告病毒利用caspase识别位点或者猪捷申病毒的2A肽在流感病毒的NA、NS1或PB2等基因片段插入报告基因，构建可表达报告蛋白的重组病毒，感染宿主细胞或宿主动物后实现成像。但由于发光机制的局限，通常对病毒滴度要求较高，与自然病毒感染过程存在较大差异；同时生物光源量子效率偏低，无法实现活体持续成像观察；此外，重组病毒基因组结构不稳定，与野生型表型存在生物学特征差异，复制能力与致病性也发生变化，报告基因也易丢失；尤其是，报告病毒策略意味着需要针对每种亚型流感病毒都需要构建新的示踪病毒。
[0007]除了重组荧光示踪病毒策略外，还有把荧光集团或量子点标记到病毒表面的示踪方法。但传统直接标记方法缺乏特异性，并干扰病毒与宿主细胞的结合，影响病毒感染效率。利用宿主细胞膜磷脂交换实现包膜病毒的囊膜标记，进而利用磷脂衍生物实现病毒囊膜生物素化或炔基化，通过与链霉亲和素或者与叠氮基的相互作用，实现量子点或者荧光探针对活病毒的标记，但叠氮等基团的修饰效率受磷脂衍生物的代谢途径和代谢效率影响大，标记基团数量受限，对实验技术要求高。总之，当前流感病毒成像技术主要集中于获得可发出稳定的光化学信号的可视化示踪病毒，本质仍局限于对病毒改造范畴，在病毒使用兼容性、高灵敏性和易用性均存在诸多不足。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种针对流感病毒的报告质粒及其构建方法和应用，以克服上述问题。
[0009]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：含有U6启动子的流感病毒报告质粒，
包括U6启动子序列和功能目的片段，所述功能目的片段包括IAV基因的3
’
NCR序列、一段正向插入的报告基因序列、IAV基因的5
’
NCR序列以及由6个胸腺嘧啶(T)组成的终止子序列。
[0010]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0011]进一步，所述U6启动子序列为人型U6启动子序列，所述报告基因为eGFP或Nluc，所述IAV基因的3
’
NCR序列为A/WSN/1933(甲型H1N1)的NP基因的3
’
NCR序列，所述IAV基因的5
’
NCR序列为A/WSN/1933(甲型H1N1)的NP基因的5
’
NCR序列，所述功能目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
[0012]其中，报告基因除了eGFP或Nluc外，还可以更换为其他的报告基因，如：荧光蛋白可以为绿色荧光蛋白、mCherry、RFP等红色荧光蛋白；萤光素酶可以为萤火虫萤光素酶(Fluc)、海肾萤光素酶(Rluc)、高斯萤光素酶(Gluc)等以及其他碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。报告基因两侧的NCR序列除了来自于A/WSN/1933(甲型H1N1)的NP片段的5
’
NCR与3
’
NCR基因序列，还可来自于不同亚型IAV病毒的不同节段基因的NCR序列，比如：A/PR8/1934(甲型H1N1)的M基因的NCR。
[0013]进一步，所述含有U6启动子的流感病毒报告质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
[0014]本专利技术的有益效果是：本专利技术利用该报告质粒作为检测病毒复制的分子模型，可快速检测病毒复制及其流感病毒聚合酶活性(最快在病毒感染8
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10小时检测出病毒，病毒最低可在MOI＝0.001左右可检出，常规可在24小时判读结果)，报告基因表达与病毒复制的水平呈一定的线性关系；同时，该报告质粒还可用于抗流感病毒药物的筛选，后续还可用于流感疫苗的疗效评价。另外，该报告质粒的启动子为U6，利用U6启动子转录，可克服种属差异性，可在广泛宿主体内表达。
[0015]同时，本专利技术无需改造病毒，即可实现病毒感染细胞后诱导特异荧光蛋白或萤光素酶表达，避免病毒重组改造为报告病毒后生物学特征发生不可预知改变的不足；同时，本专利技术适用于多种亚型流感病毒感染诱导，具有广谱性。本专利技术未来即可用于构建流感病毒感染体内外示踪，还可用于抗病毒药物筛选和快速评价研究。
[0016]本专利技术还涉及一种所述含有U6启动子的流感病毒报告质粒的构建方法，将所述功能目的片段用含有相应报告基因的质粒为模板，设计相应引物，通过添加相应碱基和酶切位点，进行PCR反应，并通过酶切、连接等分子克隆方式插入到载体质粒MLM3636上，构成含有U6启动子的流感病毒报告质粒。
[0017]进一步，所述构建方法包括以下步骤：
[0018](1)设计含有A/WSN/1933(甲型H1N1)的NP片段的两端NCR及中间开放阅读边框为eGFP或Nluc的功能目的片段，并加入流感片段的NCR序列和相应的酶切位点BsmBI；以pCAG
‑
eGFP或pNL1.1为模板，模板中加入酶切位点BsmBI，进行PCR扩增；
[0019]以pCAG
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eGFP为模板时，引物序列如下所示:
[0020]eGFP
‑
F
‑
BsmBI:ATACGTCTCGACACCGAGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTC；
[0021]eGFP
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R
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BsmBI:ATACGTCTCGAGCTTAAAAAAGTAGAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.含有U6启动子的流感病毒报告质粒，其特征在于，包括U6启动子序列和功能目的片段，所述功能目的片段包括IAV基因的3
’
NCR序列、一段正向插入的报告基因序列、IAV基因的5
’
NCR序列。还有由6个胸腺嘧啶组成的终止子序列。2.根据权利要求1所述含有U6启动子的流感病毒报告质粒，其特征在于，所述U6启动子序列为人型U6启动子序列，所述报告基因为eGFP或Nluc，所述IAV基因的3
’
NCR序列为A/WSN/1933(甲型H1N1)的NP基因的3
’
NCR序列，所述IAV基因的5
’
NCR序列为A/WSN/1933(甲型H1N1)的NP基因的5
’
NCR序列，所述功能目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求2所述一种含有U6启动子的流感病毒报告质粒，其特征在于，所述含有U6启动子的流感病毒报告质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。4.如权利要求1
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3任一项所述含有U6启动子的流感病毒报告质粒的构建方法，其特征在于，将所述功能目的片段用含有相应报告基因的质粒为模板，设计相应引物，通过添加相应碱基和酶切位点，进行PCR反应，并插入到载体质粒MLM3636上，构成含有U6启动子的流感病毒报告质粒。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计含有A/WSN/1933(甲型H1N1)的NP片段的两端NCR及中间开放阅读边框为eGFP或Nluc的功能目的片段，并加入相应的酶切位点BsmBI；以pCAG
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eGFP或pNL1.1为模板，模板中加入酶切位点BsmBI，进行PCR扩增；以pCAG
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eGFP为模板时，引物序列如下所示:eGFP
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F
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BsmBI:ATACGTCTCGACACCGAGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTC；eGFP
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R
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BsmBI:ATACGTCTCGAGCTTAAAAAAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTACTTGTA；以pNL1.1为模板时，引物序列如下所示:Nluc
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F
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BsmBI:ATACGTCTCGTACCATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCG；Nluc
‑
R
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BsmBI:ATACGTCTCGTTCTTTACGCCAGAATGCGTTCGCACAG；(2)胶回收纯化PCR产物；(3)将胶回收纯化的PCR产物及载体质粒MLM3636用限制性内切酶BsmBI进行单酶切3h，得到目的片段酶切产物和载体质粒MLM3636酶切产物；(4)将目的片段酶切产物和载体质粒MLM3636酶切产物用T4连接酶连接；(5)将连接产物加入到DH5α感受态细胞中，进行转化；(6)挑取单克隆菌斑，并进行摇床震荡培养，过后进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液进行扩大培养，进行质粒抽提并送测序鉴定，测序正确的即为所述含有U6启动子的流感病毒报告质粒。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR反应体系如下：模板1μL，P1038
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U6
‑
F
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BsmBI引物2μL，P1038
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U6
‑
R
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BsmBI引物2μL，PCR Mix 25μL，加去离子水至50μL；PCR反应条件如下：9...

【专利技术属性】
技术研发人员：户义，姜涛，李靖，杨文广，冯烨，张森，陈月红，康晓平，李裕昌，李威，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：