腺相关病毒突变体及其应用制造技术

本文提供了腺相关病毒2(AAV2)衣壳蛋白突变体，其在IV可变区包括氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列；在V可变区包括氨基酸序列TTVTQ或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列。本文提供的腺相关病毒突变体具有低肝脏嗜性和低肝毒性。低肝脏嗜性和低肝毒性。低肝脏嗜性和低肝毒性。

【技术实现步骤摘要】
腺相关病毒突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物领域中的病毒体及其应用，尤其是涉及一种具有低肝脏嗜性、高特异性的腺相关病毒突变体及其应用。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(adeno
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associated virus，AAV)是一类包裹着线性单链DNA基因组的无包膜小病毒，属于微小病毒科(Parvoviridae)依赖病毒属(Dependovirus)，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。AAV基因组为单链DNA片段，包含于非包膜病毒衣壳中，可分成三个功能区域：两个开放阅读框(Rep基因、Cap基因)和末端反向重复序列(ITR)。重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，作为基因转移载体在基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)，如基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
[0003]目前在临床试验中已有多种AAV载体被广泛使用，其中使用频率最高的是AAV2,例如已上市药物Luxturna。另外一些更新和更有效的衣壳，如AAV8、AAV9和AAVrh.10正在用于越来越多的试验。虽然可供选择的血清型不少，但每种血清型均存在一定的缺陷，尤其是由肝毒性引起的不良反应或者死亡是一个关键点。例如，诺华制药今年8月报告了两名儿童患者在接受用于治疗脊髓性肌肉萎缩症(SMA)的Zolgensma基因疗法后因急性肝衰竭而死亡。虽然这是这款“神药”首次出现这种事故，但监管机构曾警告，Zolgensma可能导致严重和潜在的致命肝脏并发症。同年2月，Homology Medicines宣布FDA已暂停HMI
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102治疗苯丙酮尿症(PKU)成人患者的临床试验，暂停原因是一名受试者肝功能检查结果异常。同样的还有安斯泰来的基因疗法AT132，该药物用于治疗X连锁肌小管性肌病，使用AAV8载体递送肌管蛋白基因至骨骼肌，从而增加组织中肌管蛋白的表达。该试验被多次暂停，原因之一即是摆脱不掉的严重肝毒性副反应。
[0004]AAV2是人类发现最早、研究最早的血清型之一，在这几十年的研究中AAV2也是研究得最清楚的血清型。相较于AAV2,AAV9在体内更为高效，在多种组织中均能有效感染。但AAV9缺点之一是其特异性差，可以同时靶向多种组织器官，特别是肝脏，例如上述药物Zolgensma就是基于AAV9为载体的。
[0005]综合上述，虽然AAV是当前最安全的基因治疗载体之一，已广泛应用于基因治疗领域，但受阻于特异性问题，特别是肝毒性的影响，很多AAV临床用药被迫中断甚至导致用药者死亡。因此开发出一款肝嗜性低，特异性好的AAV，或者基于该款AAV“骨架”为基础加入特异性靶向肽，从而到达更加特异、低毒和高效的目的，将具有巨大的临床价值和商业应用场景。

技术实现思路

[0006]在一方面，本文提供了腺相关病毒2(AAV2)衣壳蛋白突变体，其在IV可变区包括氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列；在V可变区包括氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列。
[0007]在一些实施方案中，所述IV可变区的12
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16个连续氨基酸被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，在V可变区的4
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6个连续氨基酸被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换。
[0008]在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第447
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461位氨基酸被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，第490
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494位氨基酸被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。
[0009]在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体在所述IV可变区的氨基酸序列RTNTPSGTTTQSRLQ(SEQ ID NO:4)被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，在所述V可变区的氨基酸序列KTSAD(SEQ ID NO:5)被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换。
[0010]在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第585位氨基酸为非碱性氨基酸，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。
[0011]在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第585位精氨酸(R)突变为丙氨酸(A)，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。
[0012]在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第585
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587位氨基酸缺失，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。
[0013]在一些实施方案中，所述的衣壳蛋白突变体为衣壳蛋白VP1、VP2或VP3突变体。
[0014]在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体，包括SEQ ID NO:6
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8任一项所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6
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8任一项所示的氨基酸序列至少有80％、至少90％、至少95％、或至少98％序列一致性的氨基酸序列。
[0015]另一方面，本文提供了分离的核酸分子，其编码上述衣壳蛋白突变体。
[0016]在一些实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:10
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12任一项所示核苷酸序列。
[0017]另一方面，本文提供了表达载体，其包括上述核酸分子。
[0018]另一方面，本文提供了宿主细胞，其包括上述核酸分子或表达载体。
[0019]另一方面，本文提供了宿主细胞，表达上述衣壳蛋白突变体
[0020]另一方面，本文提供了腺相关病毒(AAV)，其上述衣壳蛋白突变体。
[0021]另一方面，本文提供了制备重组腺相关病毒(rAAV)的方法，包括至少将如下组分引入宿主细胞：
[0022]1)上述核酸分子或表达载体；
[0023]2)包括目的基因的GOI质粒。
[0024]在一些实施方案中，所述目的基因的表达产物为蛋白或RNA。
[0025]另一方面，本文提供了通过上述方法制备的rAAV。
[0026]在一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.腺相关病毒2(AAV2)衣壳蛋白突变体，其在IV可变区包括氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列；在V可变区包括氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的衣壳蛋白突变体，其在所述IV可变区的12
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16个连续氨基酸被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，在所述V可变区的4
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6个连续氨基酸被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换。3.如权利要求1或2所述的衣壳蛋白突变体，其第447
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461位氨基酸被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，第490
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494位氨基酸被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。4.如权利要求1
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3任一项所述的衣壳蛋白突变体，其在所述IV可变区的氨基酸序列RTNTPSGTTTQSRLQ(SEQ ID NO:4)被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，在所述V可变区的氨基酸序列KTSAD(SEQ ID NO:5)被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换。5.如权利要求1
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4任一项所述的衣壳蛋白突变体，其第585位氨基酸为非碱性氨基酸，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。6.如权利要求1
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5任一项所述的衣壳蛋白突变体，其第585位精氨酸(R)突变为丙氨酸(A)，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。7.如权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：李华鹏，卜晔，钟育健，代志勇，张有为，潘越，陈欢，
申请(专利权)人：广州派真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：