腺相关病毒突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了腺相关病毒突变体及其应用，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白包括SEQ ID NO:1～5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1～5具有98％以上同一性、且具有相同或相似生物学功能的氨基酸序列。本发明专利技术通过对野生型腺相关病毒的外壳蛋白编码基因进行拼接重组，构建腺相关病毒库，采用抗AAV外壳蛋白的中和抗体筛选得到腺相关病毒突变体，对人源肝脏细胞的感染能力强，并能够躲避中和抗体的中和作用，有针对性地解决了血友病治疗领域存在的技术障碍。障碍。障碍。

【技术实现步骤摘要】
腺相关病毒突变体及其应用
[0001]本申请是申请号为202010442092.4专利申请的分案申请(原申请的申请日为2020年5月22日，专利技术名称为腺相关病毒突变体及其应用)。


[0002]本专利技术属于基因工程和生物工程
，涉及腺相关病毒突变体及其应用。

技术介绍

[0003]最近几年，腺相关病毒(AAV)作为基因治疗的载体应用于临床治疗多种基因缺陷病，如B型血友病、DMD进行性肌萎缩、SMA运动障碍等，取得了令人振奋的结果。尤其是AAV在血友病治疗中的成功应用，有望挽救成千上万个对常规治疗手段无效的病人。有文献报道，注射承载九因子基因的AAV后，血友病病人未出现严重的免疫反应，AAV对肝脏的损伤也是一过性的；注射AAV后，病人外周血中九因子的水平恢复至正常水平的10％左右，并且长期稳定表达，基本脱离了对九因子重组蛋白的依赖性。针对八因子缺失导致的A型血友病，初步的临床实验正在进行中。但是，编码凝血八因子的基因较长，约4.5kbp，加上启动子和终止序列，全序列的基因长度已经超过了AAV的包装范围，这是AAV基因治疗方法在治疗A型血友病中遇到的主要障碍，也是目前的研究热点。
[0004]然而，AAV基因治疗方法在治疗血友病方面也存在一些局限性。其中之一在于正常人和血友病病人的外周血中存在一定比例的抗AAV外壳蛋白中和抗体，因此，在评估病人能否进行AAV基因治疗前，需要首先检测外周血中是否存在中和抗体，如果病人体内存在抗AAV的中和抗体，便不适合进行AAV基因治疗。考虑到AAV基因治疗方法是具有广泛前景的血友病治疗方法，帮助AAV躲过体内中和抗体的清除作用就显得特别重要。
[0005]针对这一问题，研究人员提出了多种方法，包括空壳蛋白中和法、免疫抑制剂预处理法、小片段DNA中和法、AAV外壳蛋白突变法等。空壳蛋白中和法是指在注射AAV时，混入大量的AAV空壳蛋白，用以抵消AAV被体内中和抗体清除的压力，从而增加感染效率。但是研究发现，AAV空壳蛋白更容易被抗原提呈细胞提呈，激发强烈的T细胞免疫反应，增强了T细胞对AAV的清除效果，最终导致AAV的转导效率变低。免疫抑制剂预处理法是指在注射AAV前，给病人注射适量的免疫抑制剂，如地塞米松，这种方法虽然可以在一定程度上提高AAV的转导效率，但是提高程度有限，因为地塞米松对免疫的抑制是广泛的，不能特异性清除针对AAV的中和抗体以及识别AAV的T/B细胞。小片段DNA中和法是指使用能够特异性封闭AAV中和抗体的小片段DNA，应用前景较好，但是尚未出现相关临床应用报道。AAV外壳蛋白突变法是指将中和抗体识别的AAV外壳蛋白氨基酸序列中的某些位点进行突变，降低中和抗体对AAV的识别能力，从而躲避中和抗体的清除作用，目前有大量的研究报道，但是躲避中和抗体的原因和方式尚无法阐明。
[0006]因此，对AAV进行改造从而躲过体内中和抗体的清除作用，提高AAV的适用范围，在基因缺陷病治疗领域具有重要意义和广泛的应用前景。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了腺相关病毒突变体及其应用，所述腺相关病毒突变体对人源肝脏细胞的感染能力强，并能够躲避中和抗体的中和作用，有针对性地解决了存在抗AAV中和抗体的血友病患者在接受基因治疗时遇到的障碍。
[0008]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种腺相关病毒突变体，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白包括SEQ ID NO:1～5所示的氨基酸序列；
[0010]SEQ ID NO:1：
[0011]MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGGTESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDKERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPHPIGTRYLTRPL；
[0012]SEQ ID NO:2：
[0013]MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYNLNGRNSLANPGIAMASHKDDKERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腺相关病毒突变体，其特征在于，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:4所示的序列。2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的腺相关病毒突变体；优选地，所述核酸分子的核酸序列包括SEQ ID NO:9所示的序列。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括插入有权利要求2所述的核酸分子的野生型腺相关病毒载体；优选地，所述野生型腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中的任意一种，优选为AAV2。4.一种腺相关病毒库，其特征在于，所述腺相关病毒库包括权利要求1所述的腺相关病毒突变体。5.一种权利要求4所述的腺相关病毒库的构建方法，其特征在于，所述方法包括：(1)PCR扩增野生型腺相关病毒的外壳蛋白编码基因；(2)将扩增产物采用DNA酶消化后，选取长度为100～300bp的DNA片段进行重新拼接；(3)将拼接产物插入野生型腺相关病毒载体中，得到腺相关病毒载体库；(4)将所述腺相关病毒载体库与辅助质粒共转染哺乳细胞后，制备得到所述腺相关病毒库。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的PCR引物包括SEQ ID NO:11～12所示的核酸序列；优选地，步骤(2)所述拼接方法为将长度为100～300bp的DNA片段与DNA聚合酶混合，在96～41℃范围内进行梯度降温，通过Shuffling PCR得到拼接产物；优选地，步骤(3)所述野生型腺相关病毒载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴晓磊，张磊，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：