一种重组腺相关病毒载体及其在基因递送中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组腺相关病毒载体及其在基因递送中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体包含腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第447位精氨酸突变为了蛋氨酸且第456位苏氨酸突变为了丝氨酸，或者，第459位精氨酸发生了缺失且第456位苏氨酸突变为了异亮氨酸；腺相关病毒衣壳蛋白VP1的突变显著增加了所述重组腺相关病毒载体在中枢神经系统的转导效率(增加了10～20倍)，在建立中枢神经系统相关疾病模型或制备中枢神经系统相关的基因治疗药物中极具应用前景。的基因治疗药物中极具应用前景。的基因治疗药物中极具应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种重组腺相关病毒载体及其在基因递送中的应用


[0001]本专利技术涉及一种重组腺相关病毒载体及其在基因递送中的应用，属于生物


技术介绍

[0002]中枢神经系统疾病包括中枢神经系统退行性疾病和脑肿瘤。其中，中枢神经系统退行性疾病是指一组由慢性进行性的中枢神经组织退行性变性而产生的疾病的总称，病理上可见脑和/或脊髓发生神经元退行变性、丢失，主要包括帕金森病(Parkinson
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s disease，PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer
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s disease，AD)、亨廷顿病(Huntington disease，HD)和肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等。脑肿瘤是指原发于颅内组织的肿瘤及脑转移瘤，临床表现为颅内压增高及各种神经系统症状，主要包括胶质母细胞瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤等。中枢神经系统疾病通常是由遗传性基因突变引起的，这些突变导致神经系统发育异常、神经变性或神经元功能受损等。基因治疗能够通过使用基因递送载体将治疗基因递送至特定组织或细胞，纠正缺陷基因造成的异常。目前，基因治疗已被用于包括神经系统疾病在内的多种疾病的治疗。
[0003]腺相关病毒(Adeno
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associated virus,AAV)是一种单链DNA复制缺陷型细小病毒。腺相关病毒的基因组大小为4.7kb，由末端反向重复序列ITR和中间的Rep、Cap基因组成。其中，ITRs对于腺相关病毒的复制和包装具有重要作用；Rep基因编码参与腺相关病毒复制、包装和基因组整合的非结构蛋白，Cap基因编码结构蛋白VP1、VP2和VP3，3种蛋白分别按1:1:10的比例组装形成病毒衣壳，充当病毒基因传递载体。此外，Cap基因内嵌套的另一个开放阅读框编码装配激活蛋白AAP，参与衣壳蛋白的靶向和装配。腺相关病毒转导细胞主要经历了细胞表面受体介导的内吞、逃离内体、入核、脱衣壳和双链转化几个过程。进入细胞后，可以在辅助病毒的存在下进入其复制周期。
[0004]重组腺相关病毒载体(recombination adeno
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associated virus,rAAV)是在非致病的野生型腺相关病毒基础上改造而成的基因载体。与慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等其他基因治疗载体相比，腺相关病毒载体具有基因递送效率高、安全稳定和细胞毒性低等优势。迄今为止，腺相关病毒载体已被应用于许多基因治疗药物中，例如，Glybera、Luxturna、Zolgensma、Upstaza和Roctavian等。腺相关病毒血清型众多，其中，2型腺相关病毒(AAV2)是研究最为广泛的一种腺相关病毒，Luxturna和Upstaza就是使用了2型重组腺相关病毒载体。但是，在中枢神经系统的转导中，2型腺相关病毒的感染范围较为局限(参见文献：Tordo et.al.,2018；Han et.al.,2022)，因此，为使2型重组腺相关病毒载体能够更好地应用于中枢神经系统的基因递送，有必要开发在中枢神经系统转导效率更高的2型腺相关病毒。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，所述腺相关
病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失、第447位精氨酸发生了突变和/或第456位苏氨酸发生了突变。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第447位精氨酸突变为了蛋氨酸，并且，第456位苏氨酸突变为了丝氨酸；或者，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失，并且，第456位苏氨酸突变为了异亮氨酸。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
[0008]本专利技术还提供了一种腺相关病毒衣壳突变体，所述腺相关病毒衣壳突变体包含上述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体。
[0009]本专利技术还提供了一种腺相关病毒突变体，所述腺相关病毒突变体包含上述腺相关病毒衣壳突变体和基因组。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因组中，Cap基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。
[0011]本专利技术还提供了一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体包含上述腺相关病毒突变体，并且，所述腺相关病毒突变体的基因组上整合有编码目的蛋白的目的基因和/或功能性RNA。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述目的蛋白包括标记蛋白或活性蛋白中的至少一种。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述标记蛋白包括荧光蛋白或酶反应显色蛋白中的至少一种。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述标记蛋白包括BFP、CFP、GFP、YFP、RFP、iRFP、Cerulean、Venus、eGFP、eCFP、eYFP、eBFP、DsRed、dTomato、tdTomato、mCherry、mKate、mApple、mBanana、mCitrine、mOrange、mPlum、tagRFP、tagBFP、HRP、Firefly luciferase或Renilla luciferase中的至少一种。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述活性蛋白包括激活神经元蛋白、抑制神经元蛋白、钙离子信号探针蛋白、小分子信号探针蛋白、介导凋亡蛋白、疾病相关突变蛋白、生理条件下的正常蛋白、细胞因子、抗病毒因子、病毒感染辅助受体、重组酶或基因编辑工具蛋白中的至少一种。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述功能性RNA包括小RNA、小干扰RNA、小发卡RNA、小向导RNA、细胞器定位RNA、用于RNA测序的Barcode RNA或用于原位杂交分析的Barcode RNA中的至少一种。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述腺相关病毒突变体的基因组上还整合有启动子。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子包括CAG、CMV、hUbC、Ef1α、nEF、hSyn、CaMKIIα、Vgat、Thy1、TRE、UAS、GFAP、gfaABC1D、TH、RPE65、TRE、CBA、PGK、E
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SARE、C
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fos、RAM、SST、PV、mDlX、NPY、CR、TCAP、SFRP2、ChAT、TPH2、mTH、GAD67、GFAP104、CD68、Nestin、
MBP、TRPV1、L7/Pcp2、mOXT、RK、hGRK1、CAR、Grm6、ROH、Nrl、MCK、dMCK或tMCK中的至少一种。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失、第447位精氨酸发生了突变和/或第456位苏氨酸发生了突变。2.如权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第447位精氨酸突变为了蛋氨酸，并且，第456位苏氨酸突变为了丝氨酸；或者，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失，并且，第456位苏氨酸突变为了异亮氨酸。3.一种腺相关病毒衣壳突变体，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳突变体包含权利要求1或2所述的腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体。4.一种腺相关病毒突变体，其特征在于，所述腺相关病毒突变体包含权利要求3所述的腺相关病毒衣壳突变体和基因组。5.如权利要求4所述的腺相关病毒突变体，其特征在于，所述基因组中，Cap基因的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：深圳市智药跳动科技有限公司，
类型：发明
国别省市：