单细胞外显子测序方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种单细胞外显子测序方法及其应用，该方法包括：S1、肿瘤单细胞分选；S2、将分选的肿瘤单细胞进行MDA扩增，获得基因组文库；S3、检测MDA扩增产物均一性，选择多个位于不同染色体上的位点并设计对应的扩增引物，通过qPCR检测每颗单细胞MDA产物这多个位点的扩增效果，进而确定基因组是否扩增均一；S4、gDNA文库制备：将扩增后的DNA打断为150

【技术实现步骤摘要】
单细胞外显子测序方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因测序领域，本专利技术涉及单细胞外显子测序方法及其应用。

技术介绍

[0002]单细胞测序是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组等多组学进行高通量测序分析的新技术。该技术的应用使得解释单个细胞的基因结构和基因表达状态，解读细胞间的异质性成为了可能。已广泛应用于发育生物学、免疫、肿瘤等方向的研究，并且涌现出大量高质量的研究和科研成果。单细胞外显子测序对于检测基因突变和拷贝数变异具有更好的灵敏度和分辨率。相对于组织块外显子测序结果，单细胞外显子测序不仅能在一些肿瘤中常检测出更高频率突变等基因组学改变的信息，同时在研究肿瘤异质性、克隆进化等方面也具有重要意义。这对于识别癌症特征提供了前所未有的分辨率，在癌症检测、诊断和靶向治疗领域具有重要意义，并有可能揭示癌症发生发展机制及发现药物靶点。
[0003]由于肿瘤组织具有高度异质性，基于组织块的测序会掩盖低频突变，同时全基因组测序成本昂贵，产生大量数据，而人类疾病相关的突变基本都集中于占人类基因组序列的不足2％的外显子区域上。此外，单个细胞DNA(约6pg)无法满足二代测序的最低样本检测量要求，所以需要对单个细胞的基因组进行扩增，在单细胞外显子测序中我们使用MDA进行单细胞全基因组的扩增，后续通过扩增产物进行单细胞外显子建库测序分析，获得外显子区域突变信息。由于扩增会产生偏好性，其不仅导致拷贝数目变异偏差，而且导致单核苷酸变异扩增偏差，所以选取扩增均一性高的样本才是获得真实突变信息的保证。我们实验过程中通过对MDA产物进行扩增均一性实验，选取扩增均一性高的样本进行后续实验，使得扩增基因覆盖率、保真性等所有指标上都有大幅度提高，让单细胞扩增与测序更加精准。
[0004]综上，单细胞外显子测序方法活性高、操作简单、提高单个细胞外显子文库构建的成功率、降低下游实验成本等优点，大大加速单细胞外显子测序后在肿瘤进化机制研究、癌症精准分型和肿瘤耐药机制、疗效预测研究中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种肿瘤单细胞外显子测序方法及其应用，本专利技术旨在一定程度上解决相关技术中的技术问题：如何利用简单、方便的方法分离离体肿瘤组织中的单细胞并进行外显子测序。为此，专利技术人开发了一种简便的方法，可以从离体肿瘤组织样本中获得单个细胞并进行外显子测序，使单细胞测序技术可以更广泛地应用于离体肿瘤组织微环境的研究并节省成本。
[0006]第一方面：
[0007]本专利技术提供一种肿瘤单细胞外显子测序方法，包括如下步骤：
[0008]S1、肿瘤单细胞分选；
[0009]S2、将分选的肿瘤单细胞进行MDA扩增，获得基因组文库；
[0010]S3、检测MDA扩增产物均一性，选择多个位于不同染色体上的位点并设计对应的扩
增引物，通过qPCR检测每颗单细胞MDA产物多个位点的扩增效果，进而确定基因组是否扩增均一；
[0011]S4、gDNA文库制备：将扩增后的DNA打断为150
‑
200bp的片段，通过末端修复、加尾、加接头、扩增，获得gDNA文库；
[0012]S5、外显子捕获及文库构建：将制备好的gDNA文库与特定的探针进行杂交，捕获特定区域后，PCR扩增添加索引标签，获得外显子文库；
[0013]S6、将外显子文库进行测序。
[0014]步骤S3具体为：
[0015]选择多个位于不同染色体上的位点并设计对应的扩增引物，通过qPCR检测每颗单细胞MDA产物多个位点的扩增效果，进而确定基因组是否扩增均一，其中阳性对照为肿瘤组织提取的gDNA，阴性对照为无酶水(Nuclease
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Free Water)；
[0016]相对均一性值(Relative uniformity value,RUV)，计算公式如下：
[0017]Relative uniformity value(RUV)＝2
‑
(Cti
‑
Ct0)
[0018]其中，Cti表示样本i中该位点的Ct值，Ct0表示未扩增基因组DNA中同一位点的Ct值；未扩增的基因组DNA的RUV应该是1；RUV接近于1表示该位点的扩增比较均匀；所述多个位于不同染色体上的位点中，至少75％的位点的RUV值在0.25
‑
4之间的单细胞MDA产物方可视为符合条件进行下一步外显子文库构建的样品。
[0019]所述扩增引物包括以下引物对中的多对：
[0020][0021]步骤S5中，所述特定探针为Agilant SureSelect XT HumanAll ExonV6。
[0022]步骤S1包括如下步骤：
[0023]步骤1、样本准备，将待分选肿瘤细胞解离成悬液，并用细胞活性检测试剂染色检测活细胞比例及细胞总数，并过细胞滤网，去双细胞及碎片，制备成高活性的单细胞悬液；
[0024]步骤2、样品加载：启动单细胞滴定分离系统，将步骤1的肿瘤细胞悬液加到起始样品孔中，然后将孔板放置到收集位置；
[0025]步骤3、设置单细胞滴定分选参数，调整滴定位置至孔板底部中心位置；
[0026]步骤4、单细胞滴定分选：用毛细管吸取细胞，利用成像系统观察液滴状态，对液流中通过的细胞进行观察，通过调整获得样品中细胞的各个参数，调整分选的细胞粒径，以捕获活性细胞，并最终形成450
‑
600pL体积的液滴，滴定至孔板的每个孔中，每孔1个细胞并根
据留存的喷嘴区单个细胞的照片剔除空孔、多细胞孔；获得单个细胞。
[0027]单细胞滴定分离系统为CellenONE X1系统。
[0028]步骤1中，将待分选细胞用胶原蛋白酶IV解离成细胞悬液。
[0029]优选的，步骤1中，所述待分选的肿瘤患者来源的肿瘤细胞用胶原酶IV解离成单细胞悬液，再用70μm细胞滤网过滤，然后使用细胞计数仪计数。
[0030]步骤2中，所述孔板为低吸附孔板，预先每孔加入了可覆盖孔板底部的预冷无钙镁的PBS溶液。
[0031]优选的，步骤2中，所述孔板为低裙边96孔板，预先每孔加入了1.5μL预冷无钙镁的PBS溶液。
[0032]所述的外显子测序方法在肿瘤精准分型、肿瘤耐药机制研究、克隆演化研究、疗效预测研究中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0033]所述MDA扩增使用的是Single Cell Kit试剂盒。
[0034]优选的，完全培养液为含有10％FBS的DMEM培养液。
[0035]具体的，步骤1中，所述DNA超声打断使用的是Covaris M220。
[0036]所述外显子文库构建使用Agilent SureSelectXT Target Enrichment System for the Illumina Platform。
[0037]具体的，步骤2中，启动CellenONE X1单细胞滴定分离系统时，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤单细胞外显子测序方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、肿瘤单细胞分选；S2、将分选的肿瘤单细胞进行MDA扩增，获得基因组文库；S3、检测MDA扩增产物均一性，选择多个位于不同染色体上的位点并设计对应的扩增引物，通过qPCR检测每颗单细胞MDA产物这多个位点的扩增效果，进而确定基因组是否扩增均一；S4、gDNA文库制备：将扩增后的DNA打断为150
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200bp的片段，通过末端修复、加尾、加接头、扩增，获得gDNA文库；S5、外显子捕获及文库构建：将制备好的gDNA文库与特定的探针进行杂交，捕获特定区域后，PCR扩增添加索引标签，获得外显子文库；S6、将外显子文库进行测序。2.根据权利要求1所述的外显子测序方法，其特征在于，步骤S3具体为：选择多个位于不同染色体上的位点并设计对应的扩增引物，通过qPCR检测每颗单细胞MDA产物多个位点的扩增效果，进而确定基因组是否扩增均一，其中阳性对照为肿瘤组织来源提取的gDNA，阴性对照为无酶水；相对均一性值Relative uniformity value RUV，计算公式如下：Relative uniformity value RUV＝2
‑
(Cti
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Ct0)
其中，Cti表示样本i中该位点的Ct值，Ct0表示未扩增基因组DNA中同一位点的Ct值；未扩增的基因组DNA的RUV应该是1；RUV接近于1表示该位点的扩增比较均匀；多个位于不同染色体上的位点中，至少75％个位点的RUV值在0.25
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4之间的单细胞MDA产物方可视为符合条件进行下一步外显子文库构建的样品。...

【专利技术属性】
技术研发人员：何牮，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：