一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法，通过多次聚合核苷酸混合物和聚合酶以达到高效的充分聚合，从而满足测序的需求，提升测序的读长和准确性。进一步的，本发明专利技术还涉及一种试剂盒，所述试剂盒可以用于对多核苷酸进行分析或测序。酸进行分析或测序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法
专利

[0001]本专利技术涉及一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法，通过多次聚合核苷酸混合物以达到高效的充分聚合，从而满足测序的需求。进一步的，本专利技术还涉及一种试剂盒，所述试剂盒可以用于对多核苷酸进行分析或测序。
[0002]专利技术背景
[0003]高通量测序，其中以边合成边测序(sequencing by synthesis，SBS)为商业主流，主要利用DNA聚合酶及带有可逆终止和荧光标记的核苷酸来进行DNA序列的识别。它能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，具有通量高、检测速度快、灵活多用、成本低等优点。
[0004]目前，边合成边测序的具体流程为利用扩增或滚环复制等方式生成大量的DNA模板，然后锚定特定的测序引物，并向反应体系中同时添加DNA聚合酶和荧光标记的核苷酸；或者向反应体系中同时添加DNA聚合酶和荧光标记的核苷酸及没有荧光修饰的核苷酸混合液。这些dNTPs的3
’‑
OH被保护，因而每次只能添加一个dNTP。每次添加一个dNTP，DNA链的复制反应就会停止，接着激发荧光信号并进行信号的收集，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3
’‑
OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。
[0005]然而，这种测序技术对合成效率要求特别高。在多个拷贝中，一旦出现合成不完全，就会造成信号错乱，从而影响测序的准确性和测序读长。这也是目前二代测序面临的关键技术问题之一。随着人们对测序时间要求更快，通量更大，而聚合酶的反应效率有限，尤其是聚合带荧光基团的核苷酸的能力有限，就会导致聚合的效率影响测序的质量。尽管现有技术也提到采用在反应体系中同时聚合荧光标记和没有荧光修饰的核苷酸混合液来提高聚合效率，但效果仍有限。而这些聚合效率一旦跟不上测序速度，在多拷贝中出现了聚合不完全的现象，就会导致测序中信号错乱，从而限制了测序的读长和准确性。
[0006]因此，需要提供一种对多核苷酸进行测序的方法，以便提高测序的读长和准确性。

技术实现思路

[0007]本申请通过增加聚合反应的次数，以及调整参与聚合反应的核苷酸组分，使得聚合速率能够满足测序的需求，提升测序的读长和质量，从而完成了本申请。
[0008]因此，在第一方面，本申请提供了一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法，其包括
[0009](a)提供靶多核苷酸，
[0010](b)在允许杂交或退火的条件下，使所述靶多核苷酸与引物接触，从而形成包含靶多核苷酸与用作生长链的引物的部分双链体，
[0011](c)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使所述部分双链体与聚合酶和第一核苷酸混合物接触，以使得所述生长链被延伸，其中，所述第一核苷酸混合物包含至少一种经标记物标记的核苷酸；
[0012]任选地，所述第一核苷酸混合物还包含至少一种未经标记核苷酸；例如，包含选自下列的核苷酸：未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、
未经标记的第四核苷酸，或其任何组合；
[0013]其中所述第一核苷酸混合物中的各个核苷酸各自在其核糖或脱氧核糖部分包含能够可逆阻断核酸链延伸的保护基团(例如通过2
’
或3
’
氧原子附接的保护基团)；
[0014](d)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使前一步骤的产物与聚合酶和第二核苷酸混合物接触，以使得所述生长链被延伸，其中，所述第二核苷酸混合物包含至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)(1)未经标记的核苷酸、或(2)不可逆阻断核苷酸，或(3)所述未经标记的核苷酸和不可逆阻断核苷酸的组合；
[0015]在某些实施方案中，所述第二核苷酸混合物包含至少一种未经标记的核苷酸；例如，包含选自下列的核苷酸：未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，或其任何组合。
[0016]其中所述第二核苷酸混合物中的各个未经标记的核苷酸各自在其核糖或脱氧核糖部分包含能够可逆阻断核酸链延伸的保护基团(例如通过2
’
或3
’
氧原子附接的保护基团)；
[0017](e)若所述第二核苷酸混合物中的至少一种核苷酸包含不可逆阻断核苷酸，则不进行此步骤；
[0018]若所述第二核苷酸混合物不包含不可逆阻断核苷酸，则在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使前一步骤的产物与聚合酶和第三核苷酸混合物接触，以使得所述生长链被延伸；所述第三核苷酸混合物包含至少一种不可逆阻断核苷酸；
[0019](f)检测前一步骤的产物中标记物的存在，
[0020](g)去除前一步骤的产物中含有的保护基团和标记物，
[0021](h)任选地重复步骤(c)
‑
(g)一次或多次，
[0022]从而，获得所述靶多核苷酸的序列信息。
[0023]用于测定靶多核苷酸序列的方法可以这样进行：使靶多核苷酸序列变性，使靶多核苷酸分别与不同的核苷酸接触，以便形成所述靶核苷酸的互补体，并且检测所述核苷酸的掺入。所述方法利用了聚合，使得聚合酶通过掺入互补于所述靶的正确的核苷酸，以延伸所述生长链。
[0024]对每一轮聚合反应来说，所述核苷酸的掺入是通过聚合酶进行的。存在很多不同的聚合酶，并且对本领域普通技术人员来说容易确定最适合的聚合酶。优选的酶包括DNA聚合酶I、Klenow片段、DNA聚合酶III、T4或T7 DNA聚合酶、Taq聚合酶或vent聚合酶。还可以使用通过工程方法改造成具有特定性质的聚合酶。
[0025]进行聚合的条件对本领域技术人员来说是熟知的。为了进行所述聚合酶反应，通常首先使引物与所述靶多核苷酸退火，所述引物是由所述聚合酶识别的，并且起着所述生长链随后延伸的起始位点的作用。所述引物可以相对所述靶多核苷酸作为独立的成分添加。进行所述聚合酶反应所必需的其他条件，对本领域技术人员来说是熟知的，这些条件包括温度、pH、缓冲液组成。
[0026]在某些实施方案中，使本专利技术的第一核苷酸混合物与所述引物和聚合酶接触，以便能够进行第一轮的聚合。所述核苷酸可以依次添加，即分别添加每一种类型的核苷酸(A，C，G或T/U)，或同时添加。根据测序速率的需要，使本专利技术的第二核苷酸混合物与所述聚合酶再次进行接触，进行第二轮的聚合。所述核苷酸可以依次添加，即分别添加每一种类型的
核苷酸(A，C，G或T/U)，或同时添加。最后，根据第二核苷酸混合物包含或不包含双脱氧核苷酸，选择不进行或进行第三轮聚合。在某些实施方案中，所述第二核苷酸混合物不包含双脱氧核苷酸，则使本专利技术的第三核苷酸混合物与所述聚合酶接触，以便能够进行第三轮的聚合。所述核苷酸可以依次添加，即分别添加每一种类型的核苷酸(A，C，G或T/U)，或同时添加。
[0027]在某些实施方案中，除去未掺入的核苷酸。例如，通过进行洗涤步骤除去未掺入的核苷酸。
[0028]在某些实施方案中，对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法，其包括(a)提供靶多核苷酸，(b)在允许杂交或退火的条件下，使所述靶多核苷酸与引物接触，从而形成包含靶多核苷酸与用作生长链的引物的部分双链体，(c)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使所述部分双链体与聚合酶和第一核苷酸混合物接触，以使得所述生长链被延伸，其中，所述第一核苷酸混合物包含至少一种经标记物标记的核苷酸；任选地，所述第一核苷酸混合物还包含至少一种未经标记核苷酸；例如，包含选自下列的核苷酸：未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，或其任何组合；其中所述第一核苷酸混合物中的各个核苷酸各自在其核糖或脱氧核糖部分包含能够可逆阻断核酸链延伸的保护基团(例如通过2
’
或3
’
氧原子附接的保护基团)；(d)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使前一步骤的产物与聚合酶和第二核苷酸混合物接触，以使得所述生长链被延伸，其中，所述第二核苷酸混合物包含：至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)(1)未经标记的核苷酸、或(2)不可逆阻断核苷酸，或(3)所述未经标记的核苷酸和不可逆阻断核苷酸的组合；优选地，所述第二核苷酸混合物包含至少一种未经标记的核苷酸；例如，包含选自下列的核苷酸：未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，或其任何组合；其中所述第二核苷酸混合物中的各个未经标记的核苷酸各自在其核糖或脱氧核糖部分包含能够可逆阻断核酸链延伸的保护基团(例如通过2
’
或3
’
氧原子附接的保护基团)；(e)若所述第二核苷酸混合物中的至少一种核苷酸包含不可逆阻断核苷酸，则不进行此步骤；若所述第二核苷酸混合物不包含不可逆阻断核苷酸，则在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使前一步骤的产物与聚合酶和第三核苷酸混合物接触，以使得所述生长链被延伸；所述第三核苷酸混合物包含至少一种不可逆阻断核苷酸；(f)检测前一步骤的产物中标记物的存在，(g)去除前一步骤的产物中含有的保护基团和标记物，(h)任选地重复步骤(c)
‑
(g)一次或多次，从而，获得所述靶多核苷酸的序列信息。2.权利要求1的方法，其中，在步骤(c)中，所述延伸是以靶多核苷酸为模板延伸；优选地，所述延伸为延伸一个核苷酸；优选地，所述第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸和经第四标记物标记的第四核苷酸或未经标记的第四核苷酸，或者，经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸；任选地，所述第一核苷酸混合物还包含至少一种未经标记的核苷酸；或者优选地，所述第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸、经第四标记物标记的第四核苷酸、未
经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸，或者，经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸、未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸和未经标记的第三核苷酸；优选地，所述经第一标记物标记的第一核苷酸与未经标记的第一核苷酸的比率为20:1至1:10(例如，10:1至1:10，5:1至1:5，3:1至1:3)；更优选地，所述经第一标记物标记的第一核苷酸与未经标记的第一核苷酸的比率为20:1、1:10、1:1或3:2；最优选地，所述经第一标记物标记的第一核苷酸与未经标记的第一核苷酸的比率为3:2；优选地，所述经第二标记物标记的第二核苷酸与未经标记的第二核苷酸的比率为20:1至1:10(例如，10:1至1:10，5:1至1:5，3:1至1:3)；更优选地，所述经第二标记物标记的第二核苷酸与未经标记的第二核苷酸的比率为20:1、1:10、1:1或3:2；最优选地，所述经第二标记物标记的第二核苷酸与未经标记的第二核苷酸的比率为3:2；优选地，所述经第三标记物标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20:1至1:10(例如，10:1至1:10，5:1至1:5，3:1至1:3)；更优选地，所述经第三标记物标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20:1、1:10、1:1或3:2；最优选地，所述经第三标记物标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为3:2；优选地，所述经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20:1至1:10(例如，10:1至1:10，5:1至1:5，3:1至1:3)；更优选地，所述经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为20:1、1:10、1:1或3:2；最优选地，所述经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸与未经标记的第三核苷酸的比率为3:2；优选地，所述经第四标记物标记的第四核苷酸与未经标记的第四核苷酸的比率为20:1至1:10(例如，10:1至1:10，5:1至1:5，3:1至1:3)；更优选地，所述经第四标记物标记的第四核苷酸与未经标记的第四核苷酸的比率为20:1、1:10、1:1或3:2；最优选地，所述经第四标记物标记的第四核苷酸与未经标记的第四核苷酸的比率为3:2。3.权利要求1或2的方法，其中，在步骤(d)中，所述第二核苷酸混合物包含：(1)未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸；或者，(2)第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸、第四不可逆阻断核苷酸；或者，(3)包含未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，以及第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸、第四不可逆阻断核苷酸；优选地，所述未经标记的第一核苷酸与第一不可逆阻断核苷酸的比率为100:1至1:100；更优选地，所述未经标记的第一核苷酸与第一不可逆阻断核苷酸的比率为1:100、50:1或100:1；最优选地，所述未经标记的第一核苷酸与第一不可逆阻断核苷酸的比率为100:1；优选地，所述未经标记的第二核苷酸与第二不可逆阻断核苷酸的比率为100:1至1:100；更优选地，所述未经标记的第二核苷酸与第二不可逆阻断核苷酸的比率为1:100、50:1或100:1；最优选地，所述未经标记的第二核苷酸与第二不可逆阻断核苷酸的比率为100:1；
优选地，所述未经标记的第三核苷酸与第三不可逆阻断核苷酸的比率为100:1至1:100；更优选地，所述未经标记的第三核苷酸与第三不可逆阻断核苷酸的比率为1:100、50:1或100:1；最优选地，所述未经标记的第三核苷酸与第三不可逆阻断核苷酸的比率为100:1；优选地，所述未经标记的第四核苷酸与第四不可逆阻断核苷酸的比率为100:1至1:100；更优选地，所述未经标记的第四核苷酸与第四不可逆阻断核苷酸的比率为1:100、50:1或100:1；最优选地，所述未经标记的第四核苷酸与第四不可逆阻断核苷酸的比率为100:1。4.权利要求1
‑
3任一项的方法，其中，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物各自独立地相同或不同；优选地，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物不同；优选地，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物为发光标记物(例如，荧光标记物)；更优选地，所述第一标记物、第二标记物、第三标记物和第四标记物各自独立地选自香豆素、AlexaFluor、Bodipy、荧光素、四甲基罗丹明、吩噁嗪、吖啶、Cy5、Cy3、AF532、得克萨斯红及其衍生物；优选地，所述靶多核苷酸包含或是DNA，RNA，或其任何组合；优选地，所述核酸分子的延伸产物为DNA；优选地，所述靶多核苷酸获自来源于真核生物(例如，动物，植物，真菌)，原核生物(例如，细菌，放线菌)，病毒，噬菌体，或其任何组合的样品；优选地，所述第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸各自独立地选自A，T，C，G，U；优选地，所述第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸各不相同；进一步优选，所述第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸分别是A，T，C，G；优选地，所述第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸和第四不可逆阻断核苷酸各自独立地选自A，T，C，G，U；优选地，所述第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸和第四不可逆阻断核苷酸各不相同；进一步优选，所述第一不可逆阻断核苷酸、第二不可逆阻断核苷酸、第三不可逆阻断核苷酸和第四不可逆阻断核苷酸分别是A，T，C，G；优选的，所述不可逆阻断核苷酸为双脱氧核苷酸；优选地，当第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸和经第四标记物标记的第四核苷酸时；第二核苷酸混合物包含未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸；或者当第一核苷酸混合物包含经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第三标记物标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸，或者，经第一标记物标记的第一核苷酸、经第二标记物标记的第二核苷酸、经第一标记物和第二标记物共同标记的第三核苷酸和未经标记的第四核苷酸时，第二核苷酸混合物包含未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸和未经标记的第三核苷酸。
5.一种试剂盒，其包含：(a)第一核苷酸混合物，所述第一核苷酸混合物包含至少一种经标记物标记的核苷酸；任选地，所述第一核苷酸混合物还包含至少一种未经标记的核苷酸；例如，包含选自下列的核苷酸：未经标记的第一核苷酸、未经标记的第二核苷酸、未经标记的第三核苷酸、未经标记的第四核苷酸，或其任何组合；其中所述第一核苷酸混合物中的各个核苷酸各自在其核糖或脱氧核糖部分包含能够可逆阻断核酸链延伸的保护基团(例如通过2
’
或3
’
氧原子附接的保护基团)；(b)第二核苷酸混合物，所述第二核苷酸混合物包含：至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)(1)未经标记的核苷酸、或(2)不可逆阻断核苷酸，或(3)所述未经标记的核苷酸和不可逆阻断核苷酸的组合；优选地，所述第二核苷酸混合物包含至少一种未经标记的核苷酸；...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚梅花，周爽，王静静，李计广，马可心，罗宇芬，徐崇钧，蒋慧，刘健，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：