一种类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用，具体是一种骨髓间充质干细胞类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用及新型生物纳米药物载体的制备方法。本发明专利技术通过连续挤压法制备类外泌体，并通过硫酸铵梯度法成功负载阿霉素，证明其是一种产率更高、肿瘤特异性更高、心脏毒性更低、抗肿瘤效果更好的新型生物纳米药物载体。值得注意的是，这种新型纳米载体的有效载荷将不局限于阿霉素，还可以扩展到其他传统化疗药物、小分子抑制剂，甚至核酸或蛋白质药物，为开发针对神经母细胞瘤或其他儿童肿瘤的新型精准药物带来希望。带来希望。带来希望。

【技术实现步骤摘要】
一种类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用，尤其是一种骨髓间充质干细胞类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用及新型生物纳米药物载体的制备方法。。

技术介绍

[0002]神经母细胞瘤(NB)是儿童最常见的颅外实体瘤。在世界范围内，NB的发病率占所有儿童癌症的6％～10％。由于晚期NB患者易复发、远处转移和耐药，尽管积极治疗，NB患儿预后仍较差，5年总生存率小于50％。化疗是目前NB患儿综合治疗的重要组成部分。传统化疗药物虽然对肿瘤具有很高的致死率，但由于其对肿瘤的特异性较差，体内不良反应严重，成为NB治疗过程中的巨大障碍。开发靶向NB活性高、毒性低的新型药物纳米载体将是NB治疗的重大突破。
[0003]外泌体是一种几乎所有类型的细胞都积极分泌的细胞外囊泡(EV)，其大小相对均匀，直径在30nm～150nm之间，因此可以很容易地通过血液肿瘤屏障。此外，外泌体具有脂质双层膜结构，其较低的免疫原性使其能够有效地逃避免疫清除，因而可以延长血液循环时间，保护其内容物免受酶降解。此外，来自不同亲本细胞的外泌体在体内外均表现出比传统化疗药物更好的肿瘤靶向活性。基于上述优势，外泌体作为一种新型的生物纳米odds近年来被广泛研究。
[0004]然而，外泌体作为药物载体，由于产量低、耗时长、规模化制备的局限性，很难进入临床或临床前转化阶段。与外泌体相比，骨髓间充质干细胞类外泌体(exosome
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mimetics，EM)似乎是向临床转化的一个有前途的替代解决方案。将亲本细胞通过不同孔径的聚碳酸酯径迹蚀刻膜连续挤压制备成EMs，具有与亲本细胞高度相似的生物功能和特性。同时，EMs的产率远高于外泌体，具有类似的药物传递功能。EMs的脂质双分子膜结构可以保持药物稳定性、良好的组织通透性和低免疫原性。尽管EMs已被用于几种成人肿瘤治疗，但尚未有研究关注其对NB的治疗效果，NB是一种高度侵袭性的儿童肿瘤，急需靶向治疗。既往研究表明，骨髓间充质干细胞(BMSCs)在NB中可以蓄积14天。因此，我们假设骨髓间充质干细胞来源的EMs可以获得其亲本细胞向NB归巢的活性。本专利技术通过连续挤压骨髓间充质干细胞通过不同孔径的聚碳酸酯径迹蚀刻膜制备EMs，并主动负载一线化疗药物阿霉素靶向治疗NB，在体内外进一步评估其作为一种新型纳米药物载体的潜力。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种骨髓间充质干细胞类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用及新型生物纳米药物载体的制备方法。
[0006]一种类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用，其特征是所述类外泌体为骨髓间充质干细胞类外泌体。
[0007]一种新型生物纳米药物载体的制备方法，包括如下步骤：
[0008]1)细胞培养
[0009]人成神经细胞瘤细胞株SH
‑
SY5Y和SK
‑
N
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DZ分别购自国家生物医学实验细胞资源库和美国型培养库；两种细胞系均在37℃和5％ CO2条件下使用添加10％胎牛血清的Gibco DMEM高糖培养基培养；
[0010]2)外泌体的分离
[0011]利用超速离心法分离骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)来源的外泌体，收集培养72h以上的BMSCs上清，在4℃下依次经300
×
g,10min；2000
×
g,10min；10000
×
g,30min进行粗离，去除细胞碎片或死细胞。然后收集上清液，在4℃下进行超速离心，离心条件为100000
×
g,70min，浓缩外泌体，所得外泌体沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤后，再次超速离心纯化，超速离心纯化条件为100000
×
g，70min，4℃，所得纯化的外泌体沉淀用PBS重悬；最后，纯化后的外泌体经0.22μm无菌过滤器过滤后置于
‑
80℃保存；
[0012]3)EM和负载阿霉素的EM(EM
‑
Dox)的制备
[0013]EM的制备：用PBS洗涤细胞1
‑
2次后，刮取收集BMSCs，然后用微型挤出机，微型挤出机厂家为Avanti Polar Lipids,Inc.；挤压BMSC悬液依次通过不同孔径的聚碳酸酯膜过滤膜，过滤膜厂家为Whatman，过滤流程为10μm、5μm、1μm，每个孔径3次，然后用超速离心法，超速离心条件为100000
×
g,70min,4℃；浓缩纯化EM，最后经0.22μm的无菌过滤器过滤，
‑
80℃保存；
[0014]EM
‑
Dox的制备：收集骨髓间充质干细胞，分别经孔径为10μm和5μm的聚碳酸酯径迹蚀刻膜各挤压3次，超速离心纯化EM，超速离心纯化条件为100000
×
g，70min，4℃，用240mM硫酸铵溶液重悬，再经1μm聚碳酸酯径迹蚀刻膜挤压3次；然后经0.22μm的无菌过滤器过滤后参照Guo et al提出的硫酸铵浓度梯度法对阿霉素进行主动负载；再将样品转移到Slide
‑
A
‑
Lyzer，规格为MWCO 20kDa的透析盒中，室温下在pH 7.4PBS中透析过夜，去除EM外的硫酸铵；然后，在EM中加入终浓度为0.2
‑
1.0mg/mL的阿霉素，在室温下共孵育6小时，以促进主动载药；最后，样品再次转移到Slide
‑
A
‑
Lyzer透析盒中，室温下在PH7.4 PBS缓冲液中透析过夜，去除游离的阿霉素，得到纯化后的EM
‑
Dox，
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80℃保存。
[0015]有益效果：
[0016]本专利技术通过系列挤压骨髓间充质干细胞制备EMs，并主动负载一线化疗药物阿霉素靶向治疗NB，并在体内外进一步评估其作为一种新型纳米药物载体的潜力。
[0017]本专利技术通过连续挤压法制备EMs，并通过硫酸铵梯度法成功负载阿霉素，证明其是一种产率更高、肿瘤特异性更高、心脏毒性更低、抗肿瘤效果更好的新型生物纳米药物载体。值得注意的是，这种新型纳米载体的有效载荷将不局限于阿霉素，还可以扩展到其他传统化疗药物、小分子抑制剂，甚至核酸或蛋白质药物，为开发针对NB或其他儿童肿瘤的新型精准药物带来希望。
附图说明
[0018]图1为本专利技术的EM
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Dox的简单制备过程示意图。
[0019]图2为本专利技术的外泌体、EM和EM
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dox的表征示意图，图中：(A)外泌体、EM和EM
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dox的透射电镜图像显示典型的外泌体、EM和EM
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dox的形态(比例尺为200nm)；(B)粒径分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种类外泌体负载阿霉素在治疗神经母细胞瘤的应用，其特征是所述类外泌体为骨髓间充质干细胞类外泌体。2.一种新型生物纳米药物载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)细胞培养人成神经细胞瘤细胞株SH
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SY5Y和SK
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N
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DZ分别购自国家生物医学实验细胞资源库和美国型培养库；两种细胞系均在37℃和5％CO2条件下使用添加10％胎牛血清的Gibco DMEM高糖培养基培养；2)外泌体的分离利用超速离心法分离骨髓间充质干细胞来源的外泌体，收集培养72h以上的BMSCs上清，在4℃下依次经300
×
g,10min；2000
×
g,10min；10000
×
g,30min进行粗离，去除细胞碎片或死细胞；然后收集上清液，在4℃下进行超速离心浓缩外泌体，所得外泌体沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤后，再次超速离心纯化，所得纯化的外泌体沉淀用PBS重悬；最后，纯化后的外泌体经0.22μm无菌过滤器过滤后置于
‑
80℃保存；3)EM和负载阿霉素的EM的制备EM的制备：用PBS洗涤细胞1
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【专利技术属性】
技术研发人员：何大维，李慕婕，王进奎，郭鹏，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：