基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗及其制备方法和应用，本发明专利技术的方法包括以下步骤：1、利用肿瘤细胞分离得到肿瘤细胞外颗粒TMPs；2、将肿瘤细胞外颗粒与0.03ug/ul聚乙烯亚胺溶液混合反应10

【技术实现步骤摘要】
基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤治疗药物相关领域，具体涉及的是一种基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肿瘤疫苗主要由肿瘤抗原、适当的佐剂、有效的传递载体组成，并辅以有效的给药方式。根据抗原的不同传递形式，目前肿瘤疫苗可以分为三大类，包括可以编码抗原的核酸、肿瘤抗原的蛋白质和能够装载或表达癌症抗原的工程细胞。肿瘤疫苗可以通过不同的方法促进肿瘤抗原的识别，进而增强抗肿瘤免疫，达到抑制肿瘤生长甚至消灭肿瘤的目的。目前肿瘤疫苗的设计主要有以下几个方法：设计含有肿瘤相关抗原的核酸并通过电穿孔等转染方法转入细胞中使其表达肿瘤抗原增强肿瘤免疫；基于多肽或者蛋白质的疫苗则是通过筛选或计算机设计与肿瘤免疫相关的，或是可以影响肿瘤生物学特性的蛋白质或多肽，使其进入肿瘤内部发辉作用，从而达到杀伤肿瘤的目的；工程细胞疫苗是在体外对自体或异体免疫细胞进行操作(如通过与抗原共孵育刺激，或抗原负载等)，之后将其回输体内进行肿瘤治疗。
[0003]目前肿瘤疫苗的局限性主要有以下几点：
[0004](1)疫苗的免疫原性低：肿瘤抗原表达低下或抗原表位消失是造成疫苗免疫原性低的原因。(2)疫苗输送系统影响肿瘤疫苗的效果：肿瘤疫苗需要有效的传递载体提呈至免疫细胞发挥作用。(3)研发成本高，合成时间长。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是针对以上问题和要求，提供一种基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗及其制备方法和应用。
[0006]为解决以上技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1、利用肿瘤细胞分离得到肿瘤细胞外颗粒TMPs；
[0009]步骤2、将肿瘤细胞外颗粒与0.02
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0.04ug/ul聚乙烯亚胺溶液混合反应10
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20min，清洗后得到聚乙烯亚胺修饰的肿瘤细胞外颗粒TMPs
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PEI；
[0010]步骤3、将聚乙烯亚胺修饰的肿瘤细胞外颗粒与0.05
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0.15ug/ul的脂多糖溶液混合，交联反应15min
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1h，得到基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗TMPs
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PEI
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LPS。
[0011]进一步的，步骤1中，通过对肿瘤细胞进行紫外线照射和梯度离心分离得到肿瘤细胞外颗粒。
[0012]进一步的，所述步骤2中，反应温度为4℃，反应时间为15min，聚乙烯亚胺溶液浓度为0.03ug/ul。
[0013]进一步的，所述步骤3中，反应温度为4℃，反应时间为30min，脂多糖溶液浓度为0.1ug/ul。
[0014]进一步的，由上述方法制备得到。
[0015]进一步的，上述的基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗在制备肿瘤治疗药物中的应用。
[0016]本专利技术采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点：
[0017](1)我们基于肿瘤微颗粒设计肿瘤疫苗是因为肿瘤细胞微颗粒涵盖了肿瘤细胞抗原信息，包括核酸和蛋白质，是优于全细胞裂解物及外泌体的个体化全细胞抗原。而且粒径小，有利于抗原提呈细胞摄取肿瘤抗原。
[0018](2)肿瘤疫苗需要有效的传递载体提呈至免疫细胞发挥作用。而本专利技术采用肿瘤细胞微颗粒作为肿瘤抗原载体，肿瘤细胞微颗粒是肿瘤抗原良好的传递载体，具有良好的组织相容性及免疫器官靶向性，肿瘤细胞微颗粒既充当肿瘤抗原的作用，又作为载体发挥肿瘤抗原递送的作用，有助于肿瘤抗原的摄取及提呈。同时我们利用表面修饰的交联剂的电荷吸附作用，更为高效的促进肿瘤抗原的摄取。
[0019](3)采用交联剂修饰肿瘤细胞微颗粒，既促进了免疫佐剂与肿瘤抗原的耦连，又利用交联剂电荷吸附作用促进抗原提呈细胞有效摄取肿瘤抗原并发挥免疫刺激效应。将肿瘤微颗粒表面修饰免疫佐剂制备纳米材料，伪装成细菌类似物，能促进机体对肿瘤抗原的识别，肿瘤细胞微颗粒利用交联剂偶联免疫佐剂保留了其免疫刺激能力，又降低了其毒性。
[0020](4)因肿瘤微颗粒既是优质的肿瘤抗原，又是良好的抗原递送载体。因此基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗的合成，只需修饰免疫佐剂。因此研发的成本较低，合成周期短，适合临床转化。
[0021]下面结合附图和实施例对本专利技术进行详细说明。
附图说明
[0022]图1中A图为用紫外线照射和梯度离心法制造TMPs的过程和TMPs的TEM图像，B图为通过Western B l ot检测TMPs的CD63、TSG101和Ca l nex i n的表达结果图，C图为用DLS检测TMPs的分布示意图；
[0023]图2中A图为TMPs
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PE I
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LPS合成的示意图及荧光鉴定F I TC标记的LPS与D i I标记的TMPs成功偶联图像，B图为通过流式分析检测不同浓度的PE I合成TMPs
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PE I
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LPS的效率示意图，C图为考马斯亮蓝分析不同浓度的PE I合成的TMPs
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PE I
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LPS蛋白表达谱，D图为DLS分析不同浓度的PE I合成的TMPs
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PE I
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LPS的多分散指数(PD I)，E图为DLS分析不同浓度的PE I合成的TMPs
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PE I
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LPS的粒径图；F图为DLS分析不同浓度的PE I合成的TMPs
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PE I
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LPS的Zeta电位示意图；
[0024]图3中A图为树突状细胞DC2.4摄取D i I标记的TMPs
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PE I
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LPS的光镜图，B图为通过流式分析检测树突状细胞DC2.4摄取TMPs
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PE I
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LPS的效率示意图，C和D图为通过流式分析检测TMPs
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PE I
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LPS刺激DC2.4 CD80和CD86的结果示意图，E和F图为通过流式分析检测TMPs
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PE I
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LPS刺激小鼠原代细胞CD80和CD86的结果示意图，G图为EL I SA检测TMPs
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PE I
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LPS刺激DC2.4分泌TNF
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α结果示意图，H图为EL I SA检测TMPs
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PE I
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LPS刺激小鼠原代细胞分泌TNF
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α结果示意图，I图为流式分析检测TMPs
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PE I
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LPS可通过刺激巨噬细胞系RAW264.7诱导肿瘤细胞凋亡结果示意图，J图为EL I SA检测TMPs
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PE I
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LPS刺激巨噬细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、利用肿瘤细胞分离得到肿瘤细胞外颗粒TMPs；步骤2、将肿瘤细胞外颗粒与0.02
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0.04ug/ul聚乙烯亚胺溶液混合反应10
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20min，清洗后得到聚乙烯亚胺修饰的肿瘤细胞外颗粒TMPs
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PEI；步骤3、将聚乙烯亚胺修饰的肿瘤细胞外颗粒与0.05
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0.15ug/ul的脂多糖溶液混合，交联反应15min
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1h，得到基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗TMPs
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PEI
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LPS。2.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：金阳，谭淇，杨子墨，陈江彬，陈文娟，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：