用于广谱降解细胞质蛋白的纳米降解剂及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于广谱降解细胞质蛋白的纳米降解剂及其制备和应用。该纳米降解剂是由抗体作为内核和金属离子沉淀作为外壳所组成纳米粒，可通过生物矿化的方法制备得到。金属离子包括大部分过渡金属元素以及其他金属元素的二价、三价的阳离子，例如：Ca

【技术实现步骤摘要】
用于广谱降解细胞质蛋白的纳米降解剂及其制备和应用


[0001]本专利技术涉及一种用于广谱降解细胞质蛋白的纳米降解剂及其制备方法和应用，属于纳米制剂领域。

技术介绍

[0002]蛋白质的功能障碍、异常增多或蓄积会导致各种疾病，例如癌症、帕金森病、囊性纤维化、肌萎缩侧索硬化等。因此，开发降解相关致病蛋白的技术具有广泛的应用前景。近年来，在蛋白降解领域最主要和最热门的降解策略是PROTAC技术。早在2001年，加州理工大学的Raymond J.Deshaies教授和耶鲁大学的Craig M.Crews教授首次提出了蛋白水解靶向嵌合体系统(Proteolysis
‑
Targeting chimaeras，PROTAC)的概念。PROTAC系统主要有三部分组成：1)E3泛素连接酶受体，该部分主要用于招募E3泛素连接酶；2)靶标蛋白受体，该部分主要作用是与目标蛋白相结合；3)linker，该部分主要是将E3泛素连接酶受体与靶标蛋白受体相连接。PROTAC技术的靶点通常是胞内蛋白。但是PROTAC并不能解决所有的靶点问题，目前有很多靶点缺少可以结合的位点，难以开发相应的小分子药物，比如KRAS和MYC等不可成药靶点。PROTAC技术在设计和生产上有很高的技术门槛和挑战，如靶标蛋白配体设计或者发现难度较大；成药性较差，主要表现为透膜性较差，口服利用度差；另外因为其主体为三连体形式，与传统小分子药物相比分子量较大，因此其溶解度可能较差；代谢稳定性和PK/PD方面也有较大障碍；生产方面，与传统小分子药物相比生产难度更大，生产成本更高。
[0003]除了化学合成的药物可以用于蛋白降解，抗体作为蛋白降解领域的另一个支柱，也可以实现特异、高效的蛋白降解效果。抗体作为蛋白质家族的一种功能成员，由于其特异性高、副作用小，已被广泛探索用于疾病治疗。目前基于抗体的蛋白降解主要包括以下三种策略：LYTAC(lysosome
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targeting chimaeras)、AbTACs(antibody
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based PROTACs)以及Trim
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Away。其中，LYTAC和AbTACs仅限于降解细胞膜表面蛋白。该技术主要是通过利用修饰的抗体结合靶标后将靶标蛋白带入溶酶体进行降解。该技术中首先需要对抗体进行修饰—含有甘露糖
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磷酸化支链N糖原，修饰后的抗体通过甘露糖
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磷酸支链与细胞膜表面的IGF2R(阳离子
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非依赖甘露糖
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磷酸受体)结合，IGF2R是一种细胞表面的溶酶体靶向受体，主要作用是介导蛋白质向溶酶体的转运及后续的降解。因此修饰后的抗体与靶标蛋白结合后，通过IGF2R进入细胞的溶酶体内，在溶酶体内由于pH的变化，抗体与靶标蛋白分离，并导致靶标蛋白的降解，而修饰后的抗体在IGR2R的作用下，通过高尔基体再次转运到细胞膜表面完成循环利用。而AbTACs通过设计双特异性抗体，同时结合细胞膜上的E3泛素连接酶和细胞膜上的靶标蛋白，通过胞吞进入细胞并被溶酶体降解。研究人员首先设计了能够结合膜蛋白PD
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L1和RNF43的双特异抗体AC
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1。RNF43是一个单次跨膜的E3泛素连接酶，包含膜外结构域、跨膜结构域和RING细胞内结构域。AC
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1能够结合RNF43的膜外结构域，相当于PROTAC三连体中能招募E3泛素连接酶的E3泛素连接酶受体；结合靶标蛋白的Fab部分为靶标蛋白的受体，Fc部分为linker。当双抗AC
‑
1结合RNF43和PD
‑
L1后，之后通过胞吞进入细胞
并被溶酶体降解。
[0004]值得注意的是，Trim
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Away主要是一种用于降解细胞质蛋白的策略。其机制涉及细胞内抗体的受体TRIM21蛋白，该蛋白同时具备E3泛素连接酶活性和与抗体Fc段结构域高亲和的双重特性，并且TRIM21因其不可或缺的生理作用而在各种细胞类型中普遍表达。目前该技术主要通过显微注射或电穿孔在细胞水平递送抗体。
[0005]本专利技术主要基于Trim
‑
Away策略降解细胞质的蛋白。然而，该策略用于蛋白降解方面主要存在以下问题：1)抗体属于大分子蛋白，无法自主进入细胞质内；2)虽然通过显微注射或者电穿孔的方法可以将抗体导入细胞质中，但是需要昂贵的仪器设备、专业的技术人员以及复杂的实验操作，并且需要多次摸索合适的条件，不适合大规模的细胞或体内应用；3)上述技术也可能会对细胞造成严重损伤，特别是电穿孔技术。

技术实现思路

[0006]针对大分子抗体在用于胞内蛋白降解领域时存在的难以入胞，以及现有降解策略难以推广应用等问题，本专利技术拟构建一种基于生物矿化方法的纳米降解剂(Biomineralized Nano
‑
degraders,BAN)，主要是在抗体表面覆盖大量的钙磷离子等而形成保护外壳，最终形成纳米颗粒。抗体属于大分子蛋白，其表面的酸性氨基酸残基可螯合钙离子等金属离子，从而提供成核位点，通过与阴离子如磷酸盐等反应并产生微小晶粒来促进原位生物矿化。随着反应时间的延长，晶粒逐渐长大并变得更致密均匀。细胞对纳米颗粒具有天然的易摄取倾向，本研究证明BAN主要通过细胞膜表面的网格蛋白入胞途径。此外，细胞将BAN主动内吞并运输到溶酶体，然后由于溶酶体内偏酸的环境，离子外壳逐渐溶解。释放的金属离子(钙离子等)通过破坏溶酶体，将抗体从溶酶体中释放出来，并参与泛素
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蛋白酶体降解途径从而发挥蛋白降解作用。
[0007]本专利技术提供的基于生物矿化方法的纳米降解剂(Biomineralized Nano
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degraders,BAN)包含一种生物可降解的矿化纳米粒，以抗体作为蛋白模板在其外层逐渐覆盖钙磷离子等沉淀作为外壳。其中，该沉淀外壳带有正电荷，体内生物相容性较好，易于被细胞摄取和内吞；在偏酸性的环境中，纳米粒外层的钙磷离子等沉淀缓慢降解并释放抗体。抗体一方面识别细胞内的目标蛋白，一方面同时结合胞内的E 3泛素连接酶(TRIM21蛋白)，最终通过泛素
‑
蛋白酶体途径降解目标蛋白。所述矿化纳米粒的内核是抗体，所述抗体可以是商业化购买或者自制的抗体，抗体均需含有Fc段以结合胞内E3泛素连接酶(TRIM21蛋白)，从而通过后续泛素
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蛋白酶体途径进行降解，抗体靶标主要针对细胞质内蛋白质。所述矿化纳米粒的外壳是由金属阳离子和阴离子组成的沉淀物，所述金属阳离子包括大部分过渡金属元素及其他金属的二价、三价阳离子，例如选自下列金属阳离子中的一种或多种：Ca
2+
、Co
2+
、Cr
3+
、Fe
3+
、Mn
2+
、Zn
2+
、Ni
2+
、Mg
2+
、Cu
2+
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于降解细胞质蛋白的纳米降解剂，包含通过生物矿化方法制备得到的生物可降解的矿化纳米粒，其特征在于，所述矿化纳米粒以抗体作为内核，外层覆盖由金属阳离子和阴离子的沉淀物形成的外壳，其中所述抗体是含有Fc段的识别细胞内目标蛋白的抗体。2.如权利要求1所述的纳米降解剂，其特征在于，所述金属阳离子选自下列金属离子中的一种或多种：Ca
2+
、Co
2+
、Cr
3+
、Fe
3+
、Mn
2+
、Zn
2+
、Ni
2+
、Mg
2+
、Cu
2+
。3.如权利要求1所述的纳米降解剂，其特征在于，所述阴离子选自下列酸根离子中的一种或多种：磷酸根离子、磷酸氢根离子、碳酸根离子、草酸根离子、柠檬酸根离子。4.如权利要求1所述的纳米降解剂，其特征在于，所述矿化纳米粒的粒径为200
‑
500nm。5.权利要求1～4任意一项所述的纳米降解剂的制备方法，包括以下步骤：1)配制金属阳离子溶液：将含金属阳离子的化合物配制成水溶液；2)配制阴离子溶液：将含所述阴离子的化合物配制...

【专利技术属性】
技术研发人员：林志强，祝传达，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：