用于检测EGFRmRNA表达量的核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了用于检测EGFR mRNA表达量的核酸检测试剂盒，包括RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；检测体系PCR反应液包括qPCR Mix(2*)、ROX Reference Dye(50*)、检测用上下游引物EGFR

【技术实现步骤摘要】
用于检测EGFR mRNA表达量的核酸检测试剂盒


[0001]本专利技术属生命科学和生物
，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类非小细胞肺癌(NSCLC)及其它肿瘤中的EGFR表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。

技术介绍

[0002]EGFR家族与许多肿瘤的发生、发展有着密切的关系。正常的EGFR信号转导途径，配体EGF与相应的EGFR结合后可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、细胞的低分化、血管生成，以及细胞的侵袭和转移。EGFR通路的异常激活能促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移以及放射抗拒的产生，最终促进肿瘤的发生与发展。
[0003]EGFR抑制剂可以防止肿瘤细胞的侵袭和转移，并且具有放射增敏作用。厄洛替尼作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，是抗肿瘤分子靶向药物的代表性药物，在非小细胞肺癌等癌症的治疗中占有重要地位。厄洛替尼的作用途径与化疗不同，是一种靶向治疗药物，可特异性地针对肿瘤细胞作用，抑制肿瘤的形成和生长。厄洛替尼通过抑制酪氨酸激酶的活性的方式来抑制肿瘤生长，酪氨酸激酶是EGFR细胞内的重要组成部分之一。吉非替尼(Gefitinib，伊瑞可，易瑞沙)是一种口服表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR
‑
TK)抑制剂(属小分子化合物)。对EGFR
‑
TK的抑制可阻碍肿瘤的生长、转移和血管生成，并增加肿瘤细胞的凋亡。
[0004]厄洛替尼、吉非替尼等靶向治疗药物，是以EGFR为靶点，检测患者的EGFR的表达量，可为临床用药及预后判断提供一定的参考。在实际应用中，用于检测EGFR表达的方法主要为免疫组化，尽管该法原理简单，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使我们探索新的方法来检测EGFR表达水平。
[0005]实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性,而且能对PCR进行实时在线检测,反应EGFR在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间,还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法,双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于EGFR基因检测。

技术实现思路

[0006]鉴于现有技术中检测EGFR的不足，本专利技术设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测EGFR基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测EGFR mRNA的核酸检测试剂盒。
[0007]用于检测EGFR mRNA表达量的核酸检测试剂盒，包括RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于：
[0008]检测体系PCR反应液包括qPCR Mix(2*)、ROX Reference Dye(50*)、检测用上下游引物EGFR
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F/EGFR
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R和探针EGFR
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Probe、参照用上下游引物Actin
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F/Actin
‑
R探针Actin
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Probe；其中，
[0009]EGFR
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F：AACCCCGAGGGCAAATACA
[0010]EGFR
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R：GCCGTGATCTGTCACCACATA
[0011]EGFR
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Probe：FAM
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CACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCG
‑
TAMRA
[0012]Actin
‑
F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0013]Actin
‑
R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0014]Actin
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Probe：FAM
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ACCACCACGGCCGAGCGG
‑
TAMRA。
[0015]进一步地，检测用上下游引物和探针的比例优选为：EGFR
‑
F：EGFR
‑
R：EGFR
‑
Probe的摩尔比为1：1：1。
[0016]参照用上下游引物和探针的比例优选为：Actin
‑
F：Actin
‑
R：Actin
‑
Probe的摩尔比为1：1：1。
[0017]所述阳性对照品为含有EGFR基因组的溶液；所述阴性对照品为无EGFR基因组的溶液。
[0018]RNA提取液可用商业产品QIAGEN RNeasy FFPE Kit石蜡RNA抽提试剂盒替代。
[0019]使用本专利技术的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对EGFR mRNA表达量进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。利用双标准曲线法，将肿瘤组织的EGFR基因表达量与正常组织的表达水平相比，能衡量肿瘤组织的EGFR基因表达水平是否正常，可协助临床上指导厄洛替尼、吉非替尼等靶向治疗药物的使用，也有助于患者的治疗预后的判断。本研究对受测者体内肿瘤组织和正常组织的EGFR基因表达量进行检测，同时与进行比较判断，即可指导非小细胞肺癌等肿瘤的用药，也可用于辅助临床上肿瘤的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。
[0020]本专利技术的创新点在于：1.EGFR基因有8个转录本，我们的引物和探针设计在这8个转录本的公共区域，这样就可以把任何一个转录本的mRNA都扩增出来；2.这个扩增是基于RNA为模板的，所以为了避免DNA模板的干扰，我们的EGFR
‑
F设计在E7,EGFR
‑
R设计在E8上,这样就不会扩增DNA模板，因为中间有很长的E7内含子；如果我们的上下游引物在同一外显子上，那如果提取残留DNA就会被扩增而引起结果不准确；3.我们的探针设计跨在E7
‑
E8上，这样更加精确的表明扩增的只是RNA模板而非DNA模板，结果更加准确可靠，灵敏度高。
附图说明
[0021]图1是阳性检测结果示意图；
[0022]图2是阴性检测结果示意图。
具体实施方式
[0023]实施例1
[0024]本专利技术的用于检测EGFR mRNA表达量的核酸检测试剂盒，包括：
[0025]RNA提取液：QIAGEN RNeasy FFPE Kit。
[0026]检测体系PCR反应液：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(2
×
)、EGFR引物各0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测EGFR mRNA表达量的核酸检测试剂盒，包括RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于：检测体系PCR反应液包括qPCR Mix(2*)、ROX Reference Dye(50*)、检测用上下游引物EGFR
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F/EGFR
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R和探针EGFR
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Probe、参照用上下游引物Actin
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F/Actin
‑
R探针Actin
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Probe；其中，EGFR
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F：AACCCCGAGGGCAAATACAEGFR
‑
R：GCCGTGATCTGTCACCACATAEGFR
‑
Probe：FAM
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CACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCG
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TAMRAAct...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑一，陈雪青，何咏梅，
申请(专利权)人：福州艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：