一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法，通过基因工程修饰产生细胞外囊泡的细胞，使其分泌表达膜结合抗癌蛋白

【技术实现步骤摘要】
一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞制剂
，具体是一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(extracellularvesicle,EV)是一种天然的生物纳米载体，携带着从母细胞获得的脂质，糖蛋白，核酸等成分，在磷脂双分子膜层的保护作用下，其装载内容物可在血液循环系统中稳定存在；另一方面脂质双层膜的存在也使细胞外囊泡能够较为容易地穿透体内的天然屏障(如血脑屏障)将携带的内容物递送至受体细胞，参与调控细胞的信号传导。EV与化学合成的脂质体类纳米载体相比，具有其独特优点，诸如：1)天然生物纳米材料更好的安全性；2)更高的分子操作灵活性以及多类治疗分子搭载能力(比如膜表面携带抗癌蛋白，内部装载功能性核酸小分子)；3)EV输送的药物分子受到天然磷脂双层膜的保护，稳定性好；4)很强的组织渗透性(已有研究表明，EV可以通过血脑屏障，输送抗癌核酸分子到脑肿瘤中)；5)EV天然地具备一定的肿瘤靶向性；此外，通过基因工程修饰的方法，可以将肿瘤抗原融合到EV膜表面蛋白分子，增强其肿瘤靶向性；6)给药方式的多样性：肿瘤内注射或静脉输送；7)EV易于贮存，在
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20℃或
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80℃可以保存一年以上，不影响其结构和活性；
[0003]细胞外囊泡可作为纳米载体载送内源性治疗分子诸如miRNA和蛋白质，也能够载入外源性核酸分子、多肽和化学药物等用于肿瘤的靶向治疗。通过吸入制剂进行肺部给药是一种非侵袭性的局部给药方式，可直接将药物输送到肺部，实现治疗药物的靶向富集，能够避免系统性给药方式如注射和口服引起的肠胃和肝脏的药物首过效应，因此可降低药物使用剂量，减轻药物对正常组织可能造成的毒副作用。
[0004]细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是一组调节细胞周期并负责细胞有序增殖的蛋白激酶。CDK在细胞周期的不同阶段与特定的细胞周期蛋白结合，以调控细胞的增殖和存活，多年以来一直是抗癌药物研发的热门分子靶点。Dinaciclib(以下简称Dina)是第二类人工合成的新型的强效CDK抑制剂，可在纳摩尔浓度水平抑制CDK1、CDK2、CDK5和CDK9的活性，其IC50分别是3
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、1
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、1
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和4nM。已有研究表明Dina可有效抑制100种以上的肿瘤细胞株生长并诱导凋亡，并能在各种动物肿瘤模型中诱导实体肿瘤消退，具有广谱抗癌活性，应用前景很好，目前已进入了治疗肿瘤的临床III期试验。申请人研究发现，Dina可致敏耐药性肿瘤细胞对重组蛋白的应答，两者联用可产生协同增效效应，并极显著地降低各自的使用剂量。另外，MSC干细胞来源的EV具有肿瘤趋向性，可用作靶向治疗的载体。因此，将Dina载入表达重组蛋白的细胞外囊泡(EV
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T)，一方面可以发挥Dina和重组蛋白的协同治疗肿瘤效应，另外一方面，可借助EV的肿瘤趋向性实现两种药物向肿瘤的靶向共载送；再结合吸入制剂给药可进一步提高药物在肺部肿瘤的聚集，使得治疗更高效安全。
[0005]因此，本领域技术人员提供了一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0009]A.将表达重组蛋白的病毒转染产生细胞外囊泡的细胞，得到表达全长重组蛋白的细胞，
[0010]B.培养所述步骤A得到的表达重组蛋白的细胞，收集细胞培养后的上清液，从上清液中分离得到表达重组蛋白的细胞外囊泡，用磷酸盐缓冲溶液重悬表达重组蛋白的细胞外囊泡，得到表达重组蛋白的细胞外囊泡重悬液，
[0011]C.将小分子药物加入到所述步骤B中得到的表达重组蛋白的细胞外囊泡重悬液中，将小分子药物载入表达重组蛋白的细胞外囊泡，得到复合载药的细胞外囊泡重悬液，
[0012]D.将所述步骤C中得到的复合载药的细胞外囊泡重悬液雾化，得到复合载药的细胞外囊泡吸入制剂。
[0013]作为本专利技术进一步的方案：所述步骤A中病毒为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒中的至少一种。
[0014]作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤A中产生细胞外囊泡的细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞，牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、人胚肾细胞293T、巨噬细胞、NK细胞、DC细胞、T细胞、肿瘤相关成纤维细胞中的至少一种。
[0015]作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤B中分离方式为超速离心；所述超速离心的离心力为110000g，所述超速离心的温度为4℃，所述超速离心的时间为2.5h。
[0016]作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤C中载入方法为超声法、膜穿孔法、共孵育法中的至少一种；所述步骤C中载入方法为超声法。
[0017]作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤C中载入方法包括以下步骤：将小分子药物溶液与表达重组蛋白的细胞外囊泡重悬液混匀后，在冰浴中进行超声处理，超声处理后孵育以促进EV膜的自然修复，孵育结束后，通过超速离心得到复合载药的细胞外囊泡，用磷酸盐缓冲溶液重悬浮复合载药的细胞外囊泡，得到复合载药的细胞外囊泡重悬液。
[0018]作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤C中小分子药物为增加肿瘤细胞对重组蛋白敏感性的药物；所述步骤C中小分子药物为化疗药物、免疫治疗药物、天然活性产物分子、多肽和核酸类药物中的至少一种。
[0019]作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤C中小分子药物为新型CDK抑制剂。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0021]本专利技术首先通过通过基因工程修饰产生细胞外囊泡的细胞，使其分泌表达膜结合抗癌蛋白
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重组蛋白的细胞外囊泡,然后将致敏肿瘤细胞重组蛋白应答的小分子药物载入EV
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T的中空溶液腔，制备成复合载药的细胞外囊泡；通过口腔吸入给药方式治疗肺肿瘤，可以有效延长治疗药物在体内的滞留时间，减少药物在体内其它非靶点组织和器官的分布，在增强治疗效应的同时降低药物的毒副作用，并且在动物模型中表现出显著抑制耐药性肺肿瘤生长的良好治疗效应。
具体实施方式
[0022]实施例1
[0023]本专利技术实施例中，一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0024]A.将表达重组蛋白的病毒转染产生细胞外囊泡的细胞，得到表达全长重组蛋白的细胞，
[0025]B.培养所述步骤A得到的表达重组蛋白的细胞，收集细胞培养后的上清液，从上清液中分离得到表达重组蛋白的细胞外囊泡，用磷酸盐缓冲溶液重悬表达重组蛋白的细胞外囊泡，得到表达重组蛋白的细胞外囊泡重悬液，
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A.将表达重组蛋白的病毒转染产生细胞外囊泡的细胞，得到表达全长重组蛋白的细胞，B.培养所述步骤A得到的表达重组蛋白的细胞，收集细胞培养后的上清液，从上清液中分离得到表达重组蛋白的细胞外囊泡，用磷酸盐缓冲溶液重悬表达重组蛋白的细胞外囊泡，得到表达重组蛋白的细胞外囊泡重悬液，C.将小分子药物加入到所述步骤B中得到的表达重组蛋白的细胞外囊泡重悬液中，将小分子药物载入表达重组蛋白的细胞外囊泡，得到复合载药的细胞外囊泡重悬液，D.将所述步骤C中得到的复合载药的细胞外囊泡重悬液雾化，得到复合载药的细胞外囊泡吸入制剂。2.根据权利要求1所述的一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤A中病毒为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒中的至少一种。3.根据权利要求1所述的一种复合载药的细胞外囊泡吸入制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤A中产生细胞外囊泡的细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞，牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、人胚肾细胞293T、巨噬细胞、NK细胞、DC细胞、T细胞、肿瘤相关成纤维细胞中的至少一种。4.根据权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王健，赵凯，
申请(专利权)人：山东杰凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：