一种高产β-丙氨酸的工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产β

【技术实现步骤摘要】
一种高产
β
‑
丙氨酸的工程菌及其应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种高产高耐受β
‑
丙氨酸的工程菌、构建方法以及该工程菌在微生物发酵制备β
‑
丙氨酸中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]β
‑
丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，存在于某些植物和细菌中。动物的生理功能及代谢也需要其发挥作用，它是人和哺乳动物内源咪唑二肽合成的限制性氨基酸，具有增加肌肉中咪唑二肽含量，提高抗氧化能力以及抗疲劳等作用。在养殖畜牧业方面，β
‑
丙氨酸可提高动物生产性能，调控肌肉生长和肌源活性肽含量，改善肉品质量。在医药方面，β
‑
丙氨酸可用于合成泛酸、泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠和巴柳氮等。在化工方面应用于电镀、铅中毒解毒剂及合成甜味剂。在环境应用方面可合成絮凝剂，用于水的净化。β
‑
丙氨酸主要通过化学法、酶法和发酵法合成。其中，化学法包括丙烯腈法、琥珀酰亚胺降解法、β
‑
氨基丙腈法等，但存在工艺条件苛刻、副产物多、提取过程、环境不友好等不足。酶催化合成β
‑
丙氨酸虽然条件温和、提取工艺简单等优点，但该方法工艺成本较高。采用廉洁易得的葡萄糖作为起始原料，具有生产成本低、高特异性和对环境污染小等优点，具有广阔的工业应用前景。
[0003]益生大肠杆菌Nissle 1917是公认的安全菌株，它不仅可以调节宿主肠道内的菌群组成以及调节菌群平衡，通过改善人和动物肠道粘膜的免疫预防功能，减轻肠道感染后的炎症反应，而且还具有保护肠道、抑制致病菌生长、调节免疫功能等作用。此外，Nissle 1917生长速度快，符合工业生产底盘微生物所需的特性，适于工业发酵生产。通过代谢工程改造Nissle 1917生产工业产品的研究较少。
[0004]本专利技术以Nissle 1917为底盘菌开发了高产β
‑
丙氨酸的益生菌。本专利技术首先通过筛选得到对高浓度β
‑
丙氨酸有极强耐受性的一株益生菌，并通过敲除β
‑
丙氨酸的转运蛋白关键基因cycA，进一步提高了Nissle 1917对β
‑
丙氨酸的耐受能力。其次，通过在Nissle 1917中表达自行筛选获得的β
‑
丙氨酸合成酶突变体，提高了Nissle 1917产β
‑
丙氨酸的能力。再次，通过代谢途径改造进一步增强了Nissle 1917合成β
‑
丙氨酸的水平。最后，通过培养基优化和分批补料发酵条件优化，获得Nissle 1917工程菌的发酵小试生产工艺。
(三)
技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种高产β
‑
丙氨酸的工程菌及其应用，所述工程菌不仅自身对高浓度β
‑
丙氨酸有极强耐受性，且通过优化培养基配方以及分批补料等方式，使得工程菌实现β
‑
丙氨酸的高产。所述工程菌能够安全用于微生物发酵制备β
‑
丙氨酸，发酵液亦可作为益生菌营养物质用于动物养殖，改善动物肉品质量。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：
[0007]本专利技术提供一种高产β
‑
丙氨酸的工程菌，所述工程菌是以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因或pyk基因中的一种或多种，和/或过
表达panD突变基因、aspB基因、aspA基因或ppC基因中的一种或多种构建获得的；所述panD突变基因是将panD基因编码蛋白第43位的赖氨酸突变为酪氨酸获得的编码基因。
[0008]优选的，cycA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4中1007
‑
2419bp所示，fumB1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5中1004
‑
2650bp所示，aspC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6中1022
‑
2212bp所示，pyk基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7中987
‑
2429bp所示，所述panD突变基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，panD突变基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；aspB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，aspA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；ppC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0009]优选的，所述panD突变基因(panD
K43Y
)为源自枯草芽孢杆菌panD基因的突变型，所述panD突变基因表达的蛋白是将源自枯草芽孢杆菌panD基因表达的蛋白第43位赖氨酸突变为酪氨酸，其序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]优选的，所述panD突变基因、aspB基因、aspA基因或ppC基因采用启动子P
J23100
表达，所述启动子P
J23100
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]优选的，所述panD突变基因、aspB基因采用质粒pGLO进行过表达；所述aspA基因或ppC基因采用质粒pSU19进行过表达。
[0012]优选的，所述工程菌为下列之一：(1)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，采用质粒pGLO和启动子P
J23100
过表达panD突变基因，即工程菌ECN
‑
1；(2)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因，采用质粒pGLO和启动子P
J23100
过表达panD突变基因，即工程菌ECN
‑
2；(3)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因和fumB1基因，采用质粒pGLO和启动子P
J23100
过表达panD突变基因，同时采用质粒pSU19和启动子P
J23100
过表达aspA基因，即工程菌ECN
‑
3；(4)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因和aspC基因，采用质粒pGLO和启动子P
J23100
过表达panD突变基因和aspB基因，同时采用质粒pSU19和启动子P
J23100
过表达aspA基因，即工程菌ECN
‑
4；(5)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因和pyk基因，采用质粒pGLO和启动子P
J23100
过表达panD突变基因和aspB基因，采用质粒pSU19和启动子P
J23100
过表达aspA基因，即工程菌ECN
‑
5；(6)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产β
‑
丙氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以益生菌E.coliNissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因或pyk基因中的一种或多种，和/或过表达panD突变基因、aspB基因、aspA基因或ppC基因中的一种或多种构建获得的；所述panD突变基因是将panD基因编码蛋白第43位的赖氨酸突变为酪氨酸获得的编码基因。2.如权利要求1所述的高产β
‑
丙氨酸的工程菌，其特征在于，cycA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4中1007
‑
2419bp所示，fumB1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5中1004
‑
2650bp所示，aspC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6中1022
‑
2212bp所示，pyk基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7中987
‑
2429bp所示，所述panD突变基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；aspB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，aspA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；ppC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。3.如权利要求2所述的高产β
‑
丙氨酸的工程菌，其特征在于，所述panD突变基因、aspB基因、aspA基因或ppC基因采用启动子P
J23100
表达，所述启动子P
J23100
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.如权利要求3所述的高产β
‑
丙氨酸的工程菌，其特征在于，所述panD突变基因、aspB基因采用质粒pGLO进行过表达；所述aspA基因或ppC基因采用质粒pSU19进行过表达。5.如权利要求1
‑
4之一所述的高产β
‑
丙氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌为下列之一：(1)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，采用质粒pGLO和启动子P
J23100
过表达panD突变基因，即工程菌ECN
‑
1；(2)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因，采用质粒pGLO和启动子P
J23100
过表达panD突变基因，即工程菌ECN
‑
2；(3)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因和fumB1基因，采用质粒pGLO和启动子P
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过表达panD突变基因，同时采用质粒pSU19和启动子P
J23100
过表达aspA基因，即工程菌ECN
‑
3；(4)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因和aspC基因，采用质粒pGLO和启动子P
J23100
过表达panD突变基因和aspB基因，同时采用质粒pSU19和启动子P
J23100
过表达aspA基因，即工程菌ECN
‑
4；(5)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因和pyk基因，采用质粒pGLO和启动子P
J23100
过表达panD突变基因和aspB基因，采用...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙东昌，胡诗龙，陈德刚，张萍，费明月，付贝贝，黄海婵，
申请(专利权)人：黑龙江华瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：