β丙氨酸合成酶突变体、编码基因、基因工程菌及应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及涉及一种催化效率提高的β丙氨酸合成酶突变体、编码基因、基因工程菌及应用。所述β丙氨酸合成酶突变体氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术比较了不同菌株的panD基因对β

【技术实现步骤摘要】
GGAAGGAGAT AAGGTCATTA TTATTTCCTA CAAAATGATG TCTGATCAAG AAGCGGCAAG 300 CCATGAGCCG AAAGTGGCTG TTCTGAATGA TCAAAACAAA ATTGAACAAA TGCTGGGGAA 360 CGAACCAGCC CGTACAATTT TGTAG
[0012]SEQ ID No.2序列如下：
[0013]Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr Glu Ala Asn Leu
[0014]Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro
[0015]Asn Glu Tyr Val Gln Ile Val Asn Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile
[0016]Pro Gly Lys Arg Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln
[0017]Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln Glu Ala Ala Ser
[0018]His Glu Pro Lys Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn
[0019]Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu*
[0020]SEQ ID No.3序列如下：
[0021]ATGTATCGAA CAATGATGAG CGGCAAACTT CACAGGGCAA CTGTTACGGA AGCAAACCTG AACTATGTGG GAAGCATTAC AATTGATGAA GATCTCATTG ATGCTGTGGG AATGCTTCCT AATGAAAAAG TACAAATTGT GAATAATAAT AATGGAGCA CGTCTTGAAA CGTATATTAT TCCTGGTAAA CGGGGAAGCG GCGTCATATG CTTAAACGGT GCAGCCGCAC GCCTTGTGCA GGAAGGAGAT AAGGTCATTA TTATTTCCTA CAAAATGATG TCTGATCAAG AAGCGGCAAG CCATGAGCCG AAAGTGGCTG TTCTGAATGA TCAAAACAAA ATTGAACAAA TGCTGGGGAA CGAACCAGCC CGTACAATTT TGTAG
[0022]本专利技术还涉及含有所述的编码基因的重组质粒以及基因工程菌。
[0023]具体的，所述基因工程菌按如下方法构建获得：将SEQ ID No.2所示基因克隆到PET
‑
28b(+)表达载体上，得到重组质粒PET
‑
28b
‑
panD，将所得的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，获得重组大肠杆菌E
·
coli BL21
‑
[0024]PET28b
‑
panD，即所述基因工程菌。
[0025]本专利技术还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备β
‑
丙氨酸中的应用。
[0026]具体的，所述应用为：以L
‑
天冬氨酸为反应底物，以所述基因工程菌发酵获得的产酶细胞为催化剂，于缓冲液中进行反应制备β
‑
丙氨酸。
[0027]具体方法可如下：将基因工程菌液加入L
‑
天冬氨酸的水溶液(用氢氧化钠预先调节水溶液的pH值至7.0)和pH缓冲液，37℃，摇床180rpm，反应24小时，制备β
‑
丙氨酸。所述L
‑
天冬氨酸在初始反应体系中的浓度为60～100g/L，优选为80g/L。
[0028]所述基因工程菌通常需要经过预培养，具体培养方法如下：
[0029]1、从平板上分别挑取重组菌株E
·
coli BL21
‑
PET
‑
28b
‑
panD的单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素抗性的5mL LB试管里，37℃培养12h，转接1mL菌液到含有50mg/L卡那霉素抗性100mL LB摇瓶中培养，培养至OD
600
＝0.3～0.5，加入0.5mmol的IPTG，诱导12h，离心收
集菌，得到重组菌株E
·
coli BL21
‑
PET
‑
28b
‑
panD的细胞。
[0030]2、全细胞培养：培养配方：PBS磷酸缓冲液、80g/L的L
‑
天冬氨酸水溶液，将步骤1得到的细胞用磷酸缓冲液进行洗涤离心，重复步骤一次，然后将洗涤好的细胞按磷酸缓冲液和L
‑
天冬氨酸水溶液1：1的比例进行全细胞培养，培养温度：37℃，培养时间：12～24h(优选24h)。
[0031]其中，PBS的缓冲液按如下组成配制：磷酸二氢钾：0.27g；磷酸氢二钠：1.42g或者十二水合磷酸氢二钠：2.58g；氯化钠：8g；氯化钾：0.2g加去离子水约800ml(充分搅拌溶解，然后加盐酸调pH至7.4，最后定容至1L)。
[0032]本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术比较了不同菌株的panD基因对β
‑
丙氨酸产量的影响，确定了在panD基因第43号氨基酸位点进行突变，由Lys变为Tyr时，获得的重组大肠杆菌全细胞发酵所产的β
‑
丙氨酸的量达到5.04g/L，而野生型菌株所产的β
‑
丙氨酸的量为1.58g/L，提高了约3.2倍。本专利技术应用定点突变技术对panD基因进行定向改造，获得的突变菌株β
‑
丙氨酸产量明显提高，育种目标明确、效率高，具有较好应用前景。
(四)附图说明
[0033]图1为突变株与亲本和野生型的酶活对比。
[0034]图2为三种菌株不同时间生产β
‑
丙氨酸对比。
[0035]图3为重组菌株全细胞催化L
‑
天冬氨酸转化为β
‑
丙氨酸的产量对比。
(五)具体实施方式
[0036]下面结合具体实例对本专利技术做进一步详细地说明，但本专利技术并不限于以下实施例：
[0037]实施例1：大肠杆菌panD
K43Y
基因突变体的构建
[0038](1)含大肠杆菌panD基因的pET28b(+)
‑
panD质粒的获得：从实验本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种催化效率提高的β丙氨酸合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。2.编码权利要求1所述的突变体的基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。4.含有权利要求2所述的编码基因的重组质粒。5.含有权利要求2所述的编码基因的基因工程菌。6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌按如下方法构建获得：将SEQ ID No.1所示基因克隆到PET
‑
28b(+)表达载体上，得到重组质粒PET
‑
28b

【专利技术属性】
技术研发人员：孙东昌，原攀红，陈德刚，张萍，费明月，胡诗龙，付贝贝，
申请(专利权)人：黑龙江华瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：