含有糖基化Fc结构域的蛋白质的位点特异性缀合的方法技术

本文提供了用于通过转谷氨酰胺酶对聚糖完整抗体进行位点特异性缀合的方法。根据具体实施方案，将反应条件保持或降低到低离子强度条件，这允许有效且快速的缀合而不需要抗体去糖基化。还描述了与缀合方法相关的药物组合物和用途。和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含有糖基化Fc结构域的蛋白质的位点特异性缀合的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年5月20日提交的美国临时专利申请63/027,400的优先权的权益，该临时专利申请全文以引用方式并入本文并且用于所有目的。
[0003]序列表
[0004]本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。该ASCII副本创建于2021年4月27日，命名为JBI6303WOPCT1_SL.txt，大小为12,288字节。


[0005]本专利技术涉及用于在优化的缓冲液条件下通过转谷氨酰胺酶对聚糖完整抗体进行位点特异性缀合以用于生成具有更好的制造和体内特性的优化抗体
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药物
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缀合物(ADC)的方法。

技术介绍

[0006]分子与大蛋白质(诸如单克隆抗体(mAb))上的特定位点的共价连接是一项越来越重要的技术。使用位点特异性缀合(诸如抗体
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药物缀合物)的治疗平台正越来越多地进入临床开发。因此，补充或替换现有方法的新型方法具有很大的价值。
[0007]已描述的位点特异性缀合的一种方法利用了转谷氨酰胺酶(TGase)。转谷氨酰胺酶是在微生物和高等生物中具有代表性的一大类酶(Savoca等人，Micromachines(2018)9(11)：562)。这些酶催化蛋白质的赖氨酸的ε
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氨基基团和谷氨酰胺侧链的γ
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甲酰胺基团之间的共价键形成，从而产生异肽键。TGase在包括血液凝结、细胞外基质组装和孢子形成在内的多种生物过程中发挥作用。除了其天然功能之外，一些TGase还可分别使用其他酰胺或胺代替谷氨酰胺或赖氨酸侧链，并由此催化小分子底物与蛋白质的共价缀合。例如，它们可将药物的伯胺与蛋白质或肽的谷氨酰胺残基的侧链甲酰胺基团缀合，并在药物与蛋白质或肽之间形成异肽键。
[0008]已经证实来自茂原链霉菌(S.mobarensis)的微生物TGase(MTG)对于小分子与蛋白质侧链的共价缀合特别有用。MTG被示出催化PEG到包括下列的多种蛋白质中的添加：重组人IL2(Sato，Advanced drug delivery reviews(2002)，54(4)：487
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504)、干扰素(sporaore等人，Bioconjugate chemistry(2016)，27(11)：2695
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2706)和人类生长激素(Mero等人，J Control Release(2011)，154(1)：27
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34)，方式是使用氨修饰的PEG来与蛋白质的谷氨酰胺侧链缀合，或使用由含Gln的二肽修饰的PEG来与蛋白质的赖氨酸侧链缀合。在每种情况下，选择性地将PEG添加到仅一个或一小部分Gln或Lys侧链中。虽然未良好地理解茂原链霉菌(S.mobarensis)微生物TGase的底物特异性，但不同的研究已示出对谷氨酰胺底物的一定程度的序列选择性(Sugimura等人，Arch Biochem Biophys(2008)，477(2)：379
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383A)以及对二级结构的一定程度的依赖性(sporaore等人，Biochemistry(2012)，51(43)：8679
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8689)。目前，通常使用经验方法来确定MTG是否可用于特定蛋白质的选择性缀合。
[0009]MTG已用于在特定位点处将小分子选择性地缀合到单克隆抗体。已展示出两种不同的方法用于将含胺有效负载与mAb上的Gln侧链缀合，一种方法使用标记方法，并且第二种方法利用一个偶然的发现，即特定的Gln残基在某些条件下可能是良好的MTG底物。还已描述了基于标签的方法用于含有Gln有效负载与赖氨酸侧链的缀合。
[0010]Jeger等人在制备放射性免疫缀合物的过程中，展示出与Asn297处的N
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连接聚糖是完整的时相比，在去糖基化抗体的情况下用MTG修饰mAb的速率要快得多(Jeger等人，Angewandte Chemie(2010)，49(51)：9995
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9997)，并且修饰对mAb上的一个特定Gln位点具有高度特异性。确定缀合位点为Gln295，其是CH2结构域中的位置，在所有人IgG同种型上是保守的，并且是糖基化位点上游的两个残基。去糖基化之后进行MTG催化的与Gln295的缀合已成为用于制备抗体
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放射性缀合物、抗体
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药物缀合物和其他分子的传统方法。虽然MTG驱动的缀合方法不需要抗体工程化，但是这种方法的缀合需要去除Asn297处的聚糖。已经示出去除Asn297处的聚糖影响抗体的免疫学特性，因为取消了与Fc受体的结合，并且已示出影响抗体的生物物理特性，因为已经观察到热稳定性的降低，其中在去除聚糖后CH2结构域的熔融温度降低至高7℃
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8℃。
[0011]还已展示出利用转谷氨酰胺酶进行位点选择性mAb缀合的基于标签的方法。示出在mAb中的某些位置处附加或插入
″
Q
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标签
″
(短的含Gln肽，诸如LLQG)允许在标签处选择性缀合，而无需去糖基化(Strop等人，Chem Biol(2013)，20(2)：161
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167)。优选的方法是通过添加外源肽序列在mAb轻链和重链的C末端处引入Q
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标签。描述了使用c
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myc标签的类似方法(Dennler等人，Chembiochem(2015)，16(5)：861
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867)。
[0012]位点特异性缀合已成为抗体
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药物缀合物(ADC)领域中的关键关注区域(Agarwal，P.和C.R.Bertozzi，Bioconjug Chem，(2015)，26(2)：176
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92)，因为已展示出，与随机缀合相比，用位点特异性方法可增加ADC的功效和安全性两者。
[0013]然而，仍然需要将保留缀合抗体的免疫学和生物物理特性(例如将保留N
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连接聚糖且不引入含Gln的肽标签)的抗体的位点特异性缀合的有效方法以产生安全且有效的ADC。

技术实现思路

[0014]本文提供了用于在不需要抗体去糖基化的情况下对抗体进行位点特异性缀合的方法。在某些实施方案中，本专利技术提供了一种产生缀合抗体的方法，该方法包括在低离子强度条件下在转谷氨酰胺酶存在下使糖基化或聚糖完整抗体或Fc融合蛋白与胺化合物反应。
[0015]在一个方面，本文提供了用于缀合糖基化抗体的方法。该方法的一个实施方案包括在尽管存在聚糖但仍允许伯胺与抗体反应的低离子强度条件下在转谷氨酰胺酶存在下使聚糖完整抗体与伯胺化合物接触的步骤。在某些实施方案中，该抗体是糖基化的。在某些实施方案中，该抗体在Asn297处糖基化。本公开基于以下发现，低离子强度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生缀合抗体或缀合Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在低离子强度条件下在转谷氨酰胺酶存在下使糖基化抗体或糖基化Fc融合蛋白与胺化合物反应。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖基化抗体或所述糖基化Fc融合蛋白具有完整的聚糖含量。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述胺化合物是含胺有效负载，所述含胺有效负载包括细胞毒素剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标记、生物素、成像剂或第一点击反应配偶体中的一种或多种。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中在所述低离子强度条件下在所述转谷氨酰胺酶存在下使所述糖基化抗体或所述糖基化Fc融合蛋白与所述胺化合物反应之前，不使所述糖基化抗体或所述糖基化Fc融合蛋白经受用内切糖苷酶或外切糖苷酶进行的处理。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中在所述低离子强度条件下在所述转谷氨酰胺酶存在下使所述糖基化抗体或所述糖基化Fc融合蛋白与所述胺化合物反应之前，不对所述糖基化抗体或所述糖基化Fc融合蛋白的糖基化位点进行聚糖工程化或聚糖修饰。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述糖基化抗体或所述糖基化Fc融合蛋白包含在氨基酸Asn297处的N
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连接聚糖。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中在低离子强度条件下产生所述缀合抗体或所述缀合Fc融合蛋白的方法在包含约25mM或更少的盐浓度的溶液中进行。8.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中在低离子强度条件下产生所述缀合抗体或所述缀合Fc融合蛋白的方法在包含约20mM或更少的盐浓度的溶液中进行。9.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中在低离子强度条件下产生所述缀合抗体或所述缀合Fc融合蛋白的方法在包含约15mM或更少的盐浓度的溶液中进行。10.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中在低离子强度条件下产生所述缀合抗体或所述缀合Fc融合蛋白的方法在包含约10mM或更少的盐浓度的溶液中进行。11.根据权利要求7
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10中任一项所述的方法，其中低离子强度溶液包含磷酸钠、磷酸钾、HEPES、乙酸钠或Tris。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述低离子强度溶液包含磷酸钾。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述低离子强度溶液包含磷酸钠。14.根据权利要求11所述的方法，其中所述低离子强度溶液包含HEPES。15.根据权利要求11所述的方法，其中所述低离子强度溶液包含Tris。16.根据权利要求11所述的方法，其中所述低离子强度溶液包含乙酸钠。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中产生所述缀合抗体或所述缀合Fc融合蛋白的方法还包括降低含有所述糖基化抗体或所述糖基化Fc融合蛋白的溶液的离子强度，以提供所述低离子强度条件。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中产生所述缀合抗体或所述缀合Fc融合蛋白的方法还包括降低含有所述转谷氨酰胺酶的溶液的离子强度，以提供所述低离子强度条件。19.根据权利要求17或18中任一项所述的方法，其中通过稀释、或经由透析、渗滤、过滤、沉淀和/或色谱法进行缓冲液交换来降低所述离子强度。
20.根据权利要求1
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19中任一项所述的方法，其中所述转谷氨酰胺酶为微生物转谷氨酰胺酶。21.根据权利要求1
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20中任一项所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：V，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：