重组SCCA单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组SCCA单克隆抗体及其制备方法和应用，其中重组SCCA单克隆抗体包括由抗SCCA的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗SCCA的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。本发明专利技术制备的重组SCCA单克隆抗体蛋白质和基因结构明确，稳定性好，可重复表达。将制备的重组SCCA单克隆抗体应用于检测鳞状细胞癌抗原试剂盒中，临床检测灵敏度高，检测时通过对雅培样本的检测，结果发现本发明专利技术重组SCCA单克隆抗体用于试剂盒检测时的检测结果与雅培临床结果相符，与雅培试剂相比无显著差异，因此，本发明专利技术制备的重组SCCA单克隆抗体可以用于临床对血清SCCA含量的血清学检测。临床对血清SCCA含量的血清学检测。临床对血清SCCA含量的血清学检测。

【技术实现步骤摘要】
重组SCCA单克隆抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其是涉及一种重组SCCA单克隆抗体，本专利技术还涉及该单抗的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鳞状细胞癌抗原（SCCA/SCCAg）是肿瘤相关抗原TA
‑
4（Tumor Associated
‑
Antigen 4）的亚片段，最早由Kato等人从子宫颈鳞状细胞肿瘤组织中提取出来。SCCA表达量升高会使癌细胞抑制细胞凋亡，从而使机体内的几种细胞对自杀机制产生抵抗性。其中SCCA 1型主要在肿瘤组织细胞内部，其主要是木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白激酶（catL、S 和K）的抑制物，通过抑制作用可以促使癌细胞对机体内的几种细胞自杀机制产生抵抗作用，从而增强肿瘤细胞抵抗细胞程序性凋亡的能力。SCCA 2型释放于循环系统中，其主要是糜蛋白酶样蛋白激酶（catG）的抑制物，通过抑制作用可抵抗catG介导的炎症反应，从而保护肿瘤细胞免受降解。
[0003]SCCA作为鳞癌肿瘤标志物，具有较好的特异性，对于子宫颈癌、肺癌（非小细胞肺癌）等鳞状上皮细胞起源的癌症具有辅助诊断的意义。早期研究表明，患有宫颈鳞状细胞癌的妇女血清中的SCCA水平要高于健康人群的水平。同时其它相关研究也表明，血清中的SCCA水平可以指示患有宫颈鳞状细胞癌的妇女体内病灶的扩张，所以SCCA水平可有助于早期诊断、检测复发和疾病状态监测，对于其他类型的鳞状细胞癌（口腔、食道、舌、头颈等），SCCA也具有一定的辅助诊断价值。但该标志物的检测主要用于对恶性肿瘤患者病情的动态监测，不宜用于早期诊断或普通人群筛查等目的。
[0004]抗体是生物科学领域的主力，长期以来，鼠源性的单克隆抗体被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗，但是由于鼠源性的mAb会引起人抗鼠抗体（HAMA）反应，从而限制了其在临床方面的应用。因此，对鼠源性抗体特别是SCCA单克隆抗体进行改造使其安全应用在临床中是非常必要的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种重组SCCA单克隆抗体。
[0006]本专利技术还提供了上述重组SCCA单克隆抗体的制备方法。
[0007]本专利技术还提供重组SCCA单克隆抗体在制备检测鳞状细胞癌抗原试纸或试剂盒方面的应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的重组SCCA单克隆抗体，包括由抗SCCA的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗SCCA的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。
[0009]当所述轻链可变区含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列时，所述重链可变区含有如SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列；
当所述轻链可变区含有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列时，所述重链可变区含有如SEQ ID NO.6 所示的氨基酸序列。
[0010]本专利技术还提供了上述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：第一步，用免疫原制备杂交瘤细胞株并从其中提取RNA，反转录获得cDNA；第二步，设计引物，以cDNA为模板，扩增含有SEQ ID NO.1/ SEQ ID NO.5的轻链可变区和含有SEQ ID NO.2/ SEQ ID NO.6的重链可变区的编码基因；第三步，将带信号肽与轻链恒定区的表达载体和信号肽与重链恒定区的表达载体，分别进行双酶切；分别与目的轻链基因和目的重链基因采用同源重组的构建方法进程重组构建，构建成功的质粒转入感受态细胞，挑选阳性克隆测序；将测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒；第四步，将携带重链和轻链基因的质粒共转染哺乳动物细胞293F细胞或者CHO
‑
S细胞，4
‑
5天收集培养细胞上清进行蛋白纯化，得到重组SCCA单克隆抗体。
[0011]当扩增含有SEQ ID NO.1的轻链可变区和含有SEQ ID NO.2的重链可变区的编码基因时，分别构建含有如 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因，含有 SEQ ID NO.4 所示的核苷酸序列的表达载体含有人 IgG1 的重链恒定区的表达基因。
[0012]同样的，当扩增含有SEQ ID NO.5的轻链可变区和含有SEQ ID NO.6的重链可变区的编码基因时，分别构建含有如 SEQ ID NO.7 和 SEQ ID NO.8 所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQ ID NO.7 所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因，含有 SEQ ID NO.8 所示的核苷酸序列的表达载体含有人 IgG1 的重链恒定区的表达基因。
[0013]在本专利技术所述的重组SCCA单克隆抗体的制备方法中，第一步的杂交瘤细胞株的具体制备方法如下：第一步，采用重组抗原或浓缩后的人源汗液作为免疫原，首先将免疫原稀释成一定浓度后与弗氏完全佐剂或不完全佐剂进行乳化，对小鼠进行基础免疫、加强免疫和融合前冲击免疫；第二步，采用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；第三步，选取血清效价高于1:8000的鼠脾脏细胞，与骨髓瘤细胞进行体外融合，经过多次亚克隆即可获得稳定分泌抗SCCA的杂交瘤细胞株。
[0014]本专利技术还提供了一种用于检测鳞状细胞癌抗原的试纸，所述试纸是以上述重组SCCA单克隆抗体可作为检测试剂。
[0015]本专利技术还提供了一种用于检测检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒，所述试剂盒包括上述的试纸或上述的重组SCCA单克隆抗体。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：本专利技术制备的重组SCCA单克隆抗体蛋白质和基因结构明确，稳定性好，可重复表达。将制备的重组SCCA单克隆抗体应用于检测鳞状细胞癌抗原试剂盒中，临床检测灵敏度高，检测时通过对雅培样本的检测，结果发现本专利技术重组SCCA单克隆抗体用于试剂盒检测时的检测结果与雅培临床结果相符，与雅培试剂相比无显著差异，因此，本专利技术制备的重组
SCCA单克隆抗体可以用于临床对血清SCCA含量的血清学检测。
附图说明
[0017]图1是小鼠脾脏细胞和NS1融合的杂交瘤细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳。
[0018]图2是重组单克隆抗体可变区基因扩增产物电泳图。
[0019]图3是PCR筛选扩增单克隆重组抗体基因。
[0020]图3中：泳道2
‑
4为实施案例2中PCR筛选扩增单克隆重组抗体基因重链的测序图；泳道8
‑
10为实施案例2中PCR筛选扩增单克隆重组抗体基因轻链的测序图；泳道5
‑
7为实施案例3中PCR筛选扩增单克隆重组抗体基因重链的测序图；泳道11
‑
13为实施案例3中PCR筛选扩增单克隆重组抗体基因轻链的测序图。
[0021]图4是真核表达并纯化的重组单克隆抗体的SDS
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组SCCA单克隆抗体，其特征在于：包括由抗SCCA的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗SCCA的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。2.根据权利要求1所述的重组SCCA单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述重链可变区含有如SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的重组SCCA单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区含有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，所述重链可变区含有如SEQ ID NO.6 所示的氨基酸序列。4.权利要求2或3所述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：第一步，用免疫原制备杂交瘤细胞株并从其中提取RNA，反转录获得cDNA；第二步，设计引物，以cDNA为模板，扩增含有SEQ ID NO.1/ SEQ ID NO.5的轻链可变区和含有SEQ ID NO.2/ SEQ ID NO.6的重链可变区的编码基因；第三步，将带信号肽与轻链恒定区的表达载体和信号肽与重链恒定区的表达载体，分别进行双酶切；分别与目的轻链基因和目的重链基因采用同源重组的构建方法进程重组构建，构建成功的质粒转入感受态细胞，挑选阳性克隆测序；将测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒；第四步，将携带重链和轻链基因的质粒共转染哺乳动物细胞293F细胞或者CHO
‑
S细胞，4
‑
5天收集培养细胞上清进行蛋白纯化，得到重组SCCA单克隆抗体。5.根据权利要求4所述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，其特征在于：扩增含有SEQ ID NO.1的轻链可变区和含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩阳瑞，赵巧辉，李桂林，田晓平，王格，付光宇，吴学炜，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：