一种DNA四面体及其在抗猪瘟病毒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种DNA四面体，由DNA单链组成，所述DNA单链包含DNA四面体结构序列，至少一条DNA单链中还包括siRNA结合序列。优选的，在TDN中同时修饰两个不同siRNA，显著增强该分子的抗毒效果，减少因突变引起的病毒逃逸现象，充分展现出了该分子在抗病毒研究中的优势，为病毒的防控提供了新的思路。本发明专利技术克服了裸露的siRNA转染效率低，且在细胞中的半衰期极短的缺陷，本发明专利技术TDN为siRNA递送载体，显著增强了siRNA的稳定性，提高了siRNA的作用时间。此外，TDN成本低，易合成和改造，便于工业化生产，具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA四面体及其在抗猪瘟病毒中的应用


[0001]本专利技术属于生物材料领域及抗病毒药物领域，尤其涉及DNA四面体及其在抗猪瘟病毒中的应用。

技术介绍

[0002]猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。CSF可以水平传播，也可以垂直传播，家猪和野猪均极易被感染，猪仔感染CSFV后4周内其死亡率可高达90％，因此CSFV严重威胁着养猪业的经济发展(Blome,S.,et al.,Classical Swine Fever
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An Updated Review.Viruses,2017.9(4).)。先天性CSFV感染可导致动物持续性感染，使动物体内几乎不产生针对该病毒的特异性抗体，造成诊断上的困难。而持续感染的动物会不断地排出病毒，成为新的猪瘟爆发的潜在源头。此外，受感染的猪肉和猪肉制品也是CSFV的潜在来源。
[0003]控制CSFV的策略主要包括系统的预防接种疫苗和非接种疫苗的全部扑杀。2016年，22个国家正式报告了强制疫苗接种运动(OIE WAHIS)。尽管许多国家都在努力消灭CSF，但CSFV仍在南美洲和中美洲的几个国家、东欧部分地区和邻国以及亚洲(包括印度)和非洲部分地区广泛传播。因此，急需制定高效清除CSFV的新方法。随着生物技术的不断发展，转基因猪(TG)的抗毒策略应运而生，此方法可培育出在基因上对CSFV感染有抗性的转基因猪(TG)。2018年，Zicong Xie等人筛选了两个抗病毒shRNA，分别是siRNA
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>C3和siRNA
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C6。随后，通过CRISPR/Cas9介导的敲入策略将这两个shRNA插入猪Rosa26(pRosa26)基因座，产生了抗CSFV的TG猪，最终发现TG猪对病毒感染的抵抗力显著增强(Xie,Z.,et al.,Genetically modified pigs are protected from classical swine fever virus.PLoS Pathog,2018.14(12):p.e1007193.)。这一结果说明RNAi技术是抑制病毒复制的有效策略，但转基因猪的生物安全性有待进一步评价(Guzman
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Villanueva,D.,et al.,Formulation approaches to short interfering RNA and MicroRNA:challenges and implications.J Pharm Sci,2012.101(11):p.4046
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66.)。裸露的siRNA在生物系统和液体中通常被一系列核糖核酸酶消化(核糖核酸酶)或由于小而通过肾脏滤过迅速消除，且siRNA具有亲水性和聚阴离子特性，因此细胞对其摄取效率较低(Xue,H.,et al.,DNA tetrahedron
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based nanogels for siRNA delivery and gene silencing.Chem Commun(Camb),2019.55(29):p.4222
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4225.)，这些特性大大限制了siRNA的应用。因此，迫切需要找到一种合适的递送系统来保护siRNA免受核酸酶的破坏并提高其递送效率。研究发现已经发现多种用于递送siRNA的材料，例如病毒载体，脂质体和聚合物系统，但是这些载体在安全性或尺寸上仍存在一些问题。
[0004]DNA四面体(DNA四面体简称TDN，或tFNAs)是一种三维DNA纳米结构，它由四个单链DNA(ssDNA)通过互补碱基配对组装而成，每个ssDNA构成TDN的一个面。在干燥状态下，TDN的高度通常为2
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3nm(Kim,K.R.,et al.,Drug delivery by a self
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assembled DNA tetrahedron for overcoming drug resistance in breast cancer cells.Chem Commun
(Camb),2013.49(20):p.2010
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2.)，它的大小适合在动物系统中传递小分子的应用。先前的研究已经报道了DNA纳米结构在生物医学应用中的诸多特性：a)TDN具有出色的生物相容性和生物安全性(Walsh,A.S.,et al.,DNA cage delivery to mammalian cells.ACS Nano,2011.5(7):p.5427
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32.)；b)TDN可以通过内吞作用独立渗透细胞膜；c)TDN相对稳定，可以抵抗生物系统中的降解，并在细胞内保持完整至少48小时(Li,J.,et al.,Self
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assembled multivalent DNA nanostructures for noninvasive intracellular delivery of immunostimulatory CpG oligonucleotides.ACS Nano,2011.5(11):p.8783
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9.)；d)TDN可同时被不同的小分子修饰发挥多重功能(Charoenphol,P.and H.Bermudez,Aptamer
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targeted DNA nanostructures for therapeutic delivery.Mol Pharm,2014.11(5):p.1721
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5.；Jiang,D.,et al.,Multiple
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Armed Tetrahedral DNA Nanostructures for Tumor
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Targeting,Dual
‑
Modality in Vivo Imaging.ACS Appl Mater Interfaces,2016.8(7):p.4378
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84.)。因此，相比于裸露的siRNA，TDN能够更高效稳定的传递siRNA，联合TDN和RNAi技术有潜力成为新型抗病毒策略的候选者。

技术实现思路

[0005]为提高siRNA的稳定性、转染效率、安全性，并增强其作用效果，本专利技术提供了一种新型递送系统即DNA四面体(TDN，又称tFNAs)。
[0006]本专利技术提供了一种DNA四面体，由DNA单链组成，所述DNA单链包含DNA四面体结构序列，至少一条DNA单链中还包括SiRNA结合序列。
[0007]优选的是，所述DNA四面体包含4条DNA单链。每条DNA单链构成分别包含四面体结构序列，每条四面体结构序列用于形成TDN的一个面。所述4条DNA单链中，至少有1条还包括siRNA结合序列。所述siRNA结合序列连接于四面体结构序列的5
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或3
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端，所述siRNA结合序列用于将siRNA结合于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA四面体，由DNA单链组成，所述DNA单链包含DNA四面体结构序列，其特征在于，至少一条DNA单链中还包括siRNA结合序列。2.如权利要求1所述的DNA四面体，其特征在于，所述DNA单链为4条，分别包括Seq ID NO：1、Seq ID NO：2、Seq ID NO：3、Seq ID NO：4所示的DNA四面体结构序列。3.如权利要求2所述的DNA四面体，其特征在于，至少两条DNA单链中还包括siRNA结合序列。4.如权利要求3所述的DNA四面体，其特征在于，所述siRNA结合序列核苷酸序列如Seq ID NO：5和Seq ID NO：6所示。5.如权利要求4所述的DNA四面体，其特征在于，所述DNA四面体由4条DNA单链组成，所述DNA单链的核苷酸序列如Seq ID NO：1、Seq ID NO：2、Seq ID NO：7和Seq ID NO：8所示。6.权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：董海司，赵翊丞，赵大庆，
申请(专利权)人：长春中医药大学，
类型：发明
国别省市：