一种pH/过氧化氢/MMP9时序性响应微球、搭载外泌体的生物载体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种pH/过氧化氢/MMP9时序性响应微球、搭载外泌体的生物载体及应用，涉及载药载体技术领域。本发明专利技术基于SPARC高表达的调节性T细胞来源的外泌体对心脏功能的保护作用，以及梗死区域内pH、H2O2和MMP9的水平，合成了共轭肽、pH/H2O2/MMP9时序性响应微球以及搭载外泌体的生物载体。首先，通过酰腙键在酸性条件下断裂从而释放外泌体和水凝胶原料。随后，利用H2O2将Co

【技术实现步骤摘要】
一种pH/过氧化氢/MMP9时序性响应微球、搭载外泌体的生物载体及应用


[0001]本专利技术涉及载药载体
，具体而言，涉及一种pH/过氧化氢/MMP9时序性响应微球、搭载外泌体的生物载体及应用。

技术介绍

[0002]在急性心肌梗死(AMI)中,调节性T细胞(Tregs)可以抑制分化的CD4
+
T细胞、CD8
+
T细胞、Th17细胞的效应活性，以及自然杀伤细胞和B细胞的功能，还可通过调节单核/巨噬细胞分化来影响损伤的愈合过程[1]。浸润至心肌的Tregs高表达SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)，其可提高心肌梗死瘢痕中的胶原含量和成熟度，以防止心肌梗死后心脏破裂并提高存活率[2]。因此，Sparc
high
Treg在急性心肌梗死后的组织修复中发挥重要的保护作用。虽然，Tregs可在心肌梗死发生后浸润至梗死区域，但在第7天才达到峰值，这表明提前促使Sparc
high
Treg在梗死区域的峰值可能有助于梗死区域的修复，降低梗死面积，但是直接体外扩增细胞受到遗传物质和细胞存活的不稳定性而造成功能限制甚至丧失[3]。
[0003]细胞来源的外泌体具有与细胞类似的功能，其可促进血管生成，减少细胞凋亡，抑制纤维化，调节免疫反应等[4]。研究证实，包括树突状细胞经坏死的心肌细胞刺激后分泌的外泌体可通过激活Tregs减少心脏炎症，从而改善心肌梗死后的心功能和左心室重构[5]。
[0004]然而，外泌体靶向及原位驻留在心肌组织的数量限制了其治疗急性心肌梗死的效果。现目前基因工程已被广泛用于提高外泌体的靶向性和稳定性[6]。同时，许多研究已证实水凝胶是固定外泌体的良好基质[7]。然而，目前诸多水凝胶包裹外泌体的研究均通过原位注射，这会给心肌组织带来二次损伤。因此，急需开发一种与急性心肌梗死后局部微环境相容的水凝胶
‑
外泌体系统来靶向梗死部位。这种既可原位交联形成凝胶固定外泌体，又可缓慢释放外泌体的水凝胶可能为心肌梗死的治疗提供潜在方案。
[0005]通过对急性心肌梗死后局部微环境变化的分析表明，在无菌性炎症反应被激活后，第一阶段，损伤的心肌释放损伤相关分子成分并结合Toll样受体，启动趋化因子的产生，如CXCL1,CXCL2和CXCL5等，其配体为CXCR2，诱导CXCR2高表达的中性粒细胞和Ly6C
high
单核细胞的募集，释放大量促炎因子。同时，由于细胞的不断死亡并破裂，同时伴随着乳酸的不断积累，从而导致梗死区pH值的持续下降(pH<6.8)[8]，形成酸性微环境[9,10]。第二阶段，趋化至梗死区域的炎性细胞发挥促炎作用，促使活性氧簇的大量产生，包括H2O2、超氧化物和羟基自由基等，进一步损伤受损心肌[10]。第三阶段，Ly6C
low
单核细胞和M2型巨噬细胞在富集IL
‑
10、TGF
‑
β和VEGF的环境下发挥抗炎作用，同时释放基质金属蛋白酶9(MMP9)[11]。第四阶段，成纤维细胞被激活并迁移至梗死区域，在趋化因子和生长因子的作用下被转换为肌成纤维细胞，逐渐累积的MMP9的酶解反应被激活，降解细胞外基质，并促进肌成纤维细胞的增殖，促进瘢痕组织的形成[12]。
[0006]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种pH/过氧化氢/MMP9时序性响应微球、搭载外泌体的生物载体及应用以解决上述技术问题。
[0008]本专利技术利用急性心肌梗死后的炎症反应过程，通过酸性微环境(pH<6.8)使得水凝胶原料释放(微球破裂、外泌体释放)，随之利用心肌梗死后H2O2高浓度环境原位形成水凝胶固定外泌体，接着利用含量不断增加的MMP9降解水凝胶，释放外泌体，从而发挥修复心血管组织的功能。
[0009]本专利技术是这样实现的：
[0010]本专利技术提供了一种共轭肽，其包括多肽修饰的4A
‑
PEG和金属钴离子，多肽包括组氨酸和用于MMP9酶水解的肽段，用于MMP9酶水解的肽段具有如下SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，金属钴离子与组氨酸以配位键结合；金属钴离子能被H2O2氧化从而促使共轭肽呈凝胶状。
[0011]SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为：GGALGLPG。
[0012]先前研究表明，在通过肽化学合成组氨酸修饰的4A
‑
PEG水溶液中，组氨酸中的氨基和Co
2+
可形成配位键。在H2O2的作用下，Co
2+
被氧化为Co
3+
，同时4A
‑
PEG水溶液从液体变为凝胶样[14]。炎症反应第二阶段产生的H2O2和第四阶段分泌的MMP9不断在梗死区域累积[10
‑
12]，MMP9可以特异性识别和水解肽段“GALGLP”[15]。利用急性心肌梗死后不同阶段局部微环境的变化，为确保产品具有在H2O2作用下形成凝胶并在MMP9的作用下水解的特性，专利技术人使用多肽(包括组氨酸和MMP9识别和水解的肽段，即GGALGLPGH)来修饰4A
‑
PEG，结合基于金属
‑
配体相互作用的Co
2+
，最终形成4A
‑
PEG共轭肽(4APPC)。4APPC的合成结构如图S3A所示。
[0013]此外，经过验证，上述共轭肽具有良好的流动性，一旦被H2O2触发，材料表现出良好的韧性和强度，这将有助于其适应心脏的跳动特性并实现长期驻留。而一旦材料再次被MMP9触发，韧性和韧性特征消失，流动性增加，从而确保装载试剂的释放。上述共轭肽是基于H2O2响应设计的，且Co
2+
配位连接的4A
‑
PEG可在梗死区域原位形成水凝胶，固定外泌体。共轭肽中设置用于MMP9酶水解的肽段，便于后续在MMP9酶的作用下使得形成的水凝胶逐渐降解并缓慢释放外泌体。
[0014]本专利技术还提供了一种pH/H2O2/MMP9时序性响应微球，其包括：以酰腙键连接的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇形成的微球，且微球内装载有上述的共轭肽。
[0015]上述微球为两性聚合物组成，可在水中自组装并形成微球。聚合物的疏水部分形成了包裹试剂的核心，而亲水部分形成了微球结构的外壳[16]。酰腙键具有pH值敏感性，可在pH值<6.8时发生断裂[17]。根据梗死区域局部酸性微环境，可将亲脂性化合物DSPE和亲水性化合物PEG通过酰腙键(Hyd)连接，形成DSPE
‑
Hyd
‑
PEG(DHP)。经过专利技术人验证，上述微球呈均匀的球形结构，在中性溶液中保持稳定，在酸性溶液中解聚。微球(DHPM)装载4APPC形成DHPM_(4APPC),其承载能力为32.34
±
7.43wt％。
[0016]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述微球本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种共轭肽，其特征在于，其包括多肽修饰的4A
‑
PEG和金属钴离子，所述多肽包括组氨酸和用于MMP9酶水解的肽段，所述用于MMP9酶水解的肽段具有如下SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述金属钴离子与组氨酸以配位键结合；所述金属钴离子能基于H2O2响应使得所述共轭肽呈凝胶状。2.一种pH/H2O2/MMP9时序性响应微球，其特征在于，其包括：以酰腙键连接的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇形成的微球，且所述微球内装载有权利要求1所述的共轭肽。3.根据权利要求2所述的pH/H2O2/MMP9时序性响应微球，其特征在于，所述微球在pH小于6.8的环境下酰腙键断裂；优选地，所述微球装载所述共轭肽的承载量为32.34
±
7.43wt％。4.一种搭载外泌体的生物载体，其特征在于，其包括权利要求2
‑
3任一项所述的pH/H2O2/MMP9时序性响应微球，所述时序性响应微球的外周通过酰腙键连接CD63适配体，所述CD63适配体与外泌体通过外泌体表面的CD63标记物特异性结合；优选地，所述外泌体来源于干细胞或调解性T细胞；优选地，所述外泌体来源于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞或内皮祖细胞；优选地，所述CD63适配体与来源于SPARC高表达的调节性T细胞的外泌体通过外泌体表面的CD63标记物特异性结合；优选地，所述CD63适配体与来源于CXCR2高表达和SPARC高表达的调节性T细胞的外泌体通过外泌体表面的CD63标记物特异性结合；优选地，所述CXCR2高表达和SPARC高表达的调节性T细胞是经过基因编辑手段使得SPARC高表达的调节性T细胞实现CXCR2高表达，最终获得CXCR2高表达的外泌体；优选地，所述适配体的序列如SEQ ID NO：1所示；优选地，所述适配体还修饰有修饰物或标记有可被检测的标记物；优选地，所述修饰物为生物素；所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。5.一种如权利要求2
‑
3任一项所述的pH/H2O2/MMP9时序性响应微球的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将共轭肽和以酰腙键连接的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇形成的微球混合于溶剂中，然后离心，真空干燥；优选地，所述共轭肽在所述溶剂中的浓度与所述微球在所述溶剂中的浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：程攀科，李刚，陶剑虹，陈旸，韩虎魁，
申请(专利权)人：四川省医学科学院，
类型：发明
国别省市：