负载囊泡及其制备方法、试剂盒、药品和用途技术

本发明专利技术涉及一种负载囊泡及其制备方法、试剂盒、药品和用途。负载囊泡包含DNA修饰的纳米粒，囊泡层，所述囊泡层包覆在所述DNA修饰的纳米粒的外部，反义DNA，所述反义DNA负载于所述纳米粒和/或所述囊泡层上；制备方法包含：将DNA修饰的纳米粒和囊泡层进行组装，得到框架，将反义DNA与所述框架混合进行反应，以便所述反义DNA负载于所述DNA修饰的纳米粒或所述囊泡层上，制得负载囊泡。该负载囊泡进入细胞后，能够释放反义DNA，其能够靶向与mRNA互补结合后，抑制mRNA翻译，从而促进癌细胞凋亡，具有稳定性强和可控释放反义DNA等优点；并且，该制备方法操作简单。方法操作简单。

【技术实现步骤摘要】
负载囊泡及其制备方法、试剂盒、药品和用途


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，涉及一种负载囊泡及其制备方法、试剂盒、药品和用途。

技术介绍

[0002]近年来，人们开发了多种抗癌药物，包括小分子化疗药物。然而，传统的化疗药物带来了严重的副作用，包括全身毒性和多药耐药性(MDR)等。基于核酸的治疗方法的出现提供了替代性抗癌治疗，这有助于改善小分子治疗药物的副作用。
[0003]因此，亟需提供一种稳定有效的核酸药物。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种负载囊泡及其制备方法、试剂盒、药品和用途，该负载囊泡负载有反义DNA，其进入到细胞内，能促进癌细胞凋亡，且具有稳定性高、可控释放反义DNA等优点；并且，该制备方法具有操作简单等优点。
[0005]需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的：
[0006]反义寡核苷酸主要由15
‑
25个核苷酸组成，包括反义DNA和反义RNA。反义DNA的化学治疗机制提供了一种遗传水平层面的途径，通过合理设计高度序列特异性的核酸药物，能够靶向与信使RNA(mRNA)结合，从而通过空间阻断mRNA翻译。但是，专利技术人发现，反义DNA分子量大、带负电荷，在没有人工载体的情况下很难穿透细胞膜，并且，传统的反义DNA在细胞内环境中容易被酶降解，使其抑制mRNA翻译的作用大大降低。
[0007]有鉴于此，专利技术人通过大量试验发现，采用聚(丙)二醇(PPO)化学共轭和可还原的二硫化物键修饰反义DNA，然后将其负载于囊泡层或纳米粒上，从而使反义DNA能够顺利穿过细胞膜进入到细胞内，抑制mRNA翻译，达到促进癌细胞凋亡的目的，并且，该负载囊泡含有反义DNA，具有稳定性强和可控释放反义DNA等优点。
[0008]因而，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种负载囊泡。根据本专利技术的实施例，所述负载囊泡包含：DNA修饰的纳米粒；囊泡层，所述囊泡层包覆在所述DNA修饰的纳米粒的外部；反义DNA，所述反义DNA负载于所述纳米粒和/或所述囊泡层上。
[0009]专利技术人通过大量试验发现，该负载囊泡中含有反义DNA，以提高其靶向作用效果。具体地，负载囊泡进入细胞后，能够在胞内还原环境下解组装，释放反义DNA，其靶向与mRNA互补结合后，在RNAse H酶的作用下，抑制mRNA翻译，从而促进癌细胞凋亡；并且，该负载囊泡含有反义DNA，具有稳定性强和可控释放反义DNA等优点。
[0010]根据本专利技术的实施例，上述囊泡还进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
[0011]根据本专利技术的实施例，所述囊泡层包括组装DNA，所述组装DNA的至少一部分与所述纳米粒上的修饰DNA的至少一部分互补。由此，通过组装DNA的至少一部分与所述纳米粒上的修饰DNA的至少一部分互补，使组装DNA和修饰DNA互补结合，从而实现囊泡层和DNA修
饰的纳米粒组装成负载囊泡的框架。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述组装DNA为PPO
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S
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S
‑
b
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DNA或者PPO
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S
‑
S
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b
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DNA。由此，利用PPO
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S
‑
S
‑
b
‑
DNA引入氧化还原响应性的二硫键，后期利用框架诱导自组装的策略得到具有响应性的负载囊泡。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述纳米粒为金纳米粒，所述修饰DNA为巯基DNA。由此，巯基DNA通过Au
‑
S键链接到纳米粒上，形成DNA修饰的纳米粒。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述金纳米粒的直径为10
‑
15nm。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述纳米粒为二水合双(对
‑
磺酰苯基)苯基膦化二钾盐保护的金纳米粒。由此，通过二水合双(对
‑
磺酰苯基)苯基膦化二钾盐(BSPP)对纳米粒进行保护，使金纳米颗粒能够稳定存在，不容易聚沉。根据本专利技术的实施例，所述反义DNA与所述组装DNA的序列相同。专利技术人通过大量试验发现，当反义DNA和组装DNA的序列相同时，当负载囊泡进入到细胞中，组装DNA上的DNA序列被释放，其能够靶向与mRNA互补结合，抑制mRNA翻译，进一步促进癌细胞凋亡。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述反义DNA和所述组装DNA具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或者具有与其至少80％同源性的核苷酸序列。专利技术人通过大量试验发现，该反义DNA序列能够阻止Bcl
‑
2mRNA的翻译，从而促进乳腺癌细胞凋亡。其中，SEQ ID NO:1为TCTCCCAGCGTGCGCCAT。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述修饰DNA具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者具有与其至少80％同源性的核苷酸序列。由此，该修饰DNA的部分序列与组装DNA的部分序列互补，从而将DNA修饰的纳米金与组装DNA互补结合形成框架。其中，SEQ ID NO:2为TTTATGGCGCACGCTGGG。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述反义DNA为PPO
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S
‑
S
‑
b
‑
DNA或者PPO
‑
S
‑
S
‑
DNA。专利技术人通过试验发现，将PPO化学共轭和可还原的二硫化物键修饰反义DNA，在提高反义DNA稳定性的基础上，又能对反义DNA进行可控释放。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述负载囊泡的直径为30
‑
50nm，由此，该负载囊泡含有反义DNA，具有稳定性强和可控释放反义DNA等优点，可进一步促进癌细胞凋亡。
[0020]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种制备上述的负载囊泡的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包含：(1)将DNA修饰的纳米粒和囊泡层进行组装，得到框架；(2)将反义DNA与所述框架混合进行反应，以便所述反义DNA负载于所述DNA修饰的纳米粒或所述囊泡层上，制得负载囊泡。
[0021]根据本专利技术的实施例，先将DNA修饰的纳米粒和囊泡层组装得到框架，然后加入反义DNA，使反义DNA在框架周围通过疏水作用力形成负载囊泡。该制备方法能够将反义DNA有效地负载于框架上，且制备方法操作简单，制得的负载囊泡稳定性强。
[0022]根据本专利技术的实施例，步骤(2)中，所述反义DNA与所述框架于25
‑
40℃条件下反应30
‑
60min。专利技术人通过大量试验发现，采用上述温度，能够使亲水的框架变为疏水的框架，在疏水基团的诱导下，可使反义DNA在框架周围通过疏水作用力形成负载囊泡。
[0023]根据本专利技术的实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种负载囊泡，其特征在于，包含：DNA修饰的纳米粒；囊泡层，所述囊泡层包覆在所述DNA修饰的纳米粒的外部；反义DNA，所述反义DNA负载于所述纳米粒和/或所述囊泡层上。2.根据权利要求1所述的负载囊泡，其特征在于，所述囊泡层包括组装DNA，所述组装DNA的至少一部分与所述纳米粒上的修饰DNA的至少一部分互补；任选地，所述组装DNA为PPO
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S
‑
S
‑
b
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DNA或者PPO
‑
S
‑
S
‑
DNA；任选地，所述纳米粒为金纳米粒，所述修饰DNA为巯基DNA；任选地，所述纳米粒为二水合双(对
‑
磺酰苯基)苯基膦化二钾盐保护的金纳米粒。3.根据权利要求2所述的负载囊泡，其特征在于，所述反义DNA与所述组装DNA的序列相同；任选地，所述反义DNA和所述组装DNA具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或者具有与其至少80％同源性的核苷酸序列；任选地，所述修饰DNA具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者具有与其至少80％同源性的核苷酸序列；任选地，所述反义DNA为PPO
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S
‑
S
‑
b
‑
DNA或者PPO
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S
‑
S
‑
DNA；任选地，所述负载囊泡的直径为30
‑
50nm。4.一种制备权利要求1
‑
3任一项所述的负载囊泡的方法，其特征在于，包含：(1)将DNA修饰的纳米粒和囊泡层进行组装，得到框架；(2)将反义DNA与所述框架混合进行反应，以便所述反义DNA负载于所述DNA修饰的纳米粒或所述囊泡层上，制得所述负载囊泡。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反义DNA与所述框架于25
‑
40℃条件下反应15
‑
60min；任选地，所述反义DNA与所述框架的摩尔比600
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1000：1，优选为660
‑
670:1。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述DNA修饰的纳米粒的制备步骤包含：将巯基DNA与金纳米粒加入至缓冲液中静置12
‑
24h，然后加入NaCl至终浓度为400
‑
600mM，继续反应得到含有DNA修饰的纳米粒的粗液；任选地，所述巯基DNA的摩尔量为所述金纳米粒摩尔量的100
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400倍，优选为200倍；任选地，所述缓冲液包含0.4
‑
0....

【专利技术属性】
技术研发人员：董原辰，章亚男，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：