一种用于检测血液中11-脱氢血栓烷B2的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于检测血液中11

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测血液中11
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脱氢血栓烷B2的液相色谱
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串联质谱方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于医学检验分析
，具体地说是一种用于检测血液中11
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脱氢血栓烷B2的液相色谱
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串联质谱方法和试剂盒。
技术背景
[0002]11
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脱氢血栓烷B2(11
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dehydro
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thromboxane B2，11dhTXB2)是血栓烷素A2(thromboxane A2，TXA2)的终末代谢产物，主要经肾排出。血栓烷素A2(TXA2)是一种前列腺素的代谢产物，在止血和心血管疾病的发生过程中均起到重要作用。TXA2有强烈的缩血管作用，还可通过结合血栓烷素血小板受体(TPR)激活血小板，促进其聚集，从而发挥促血栓形成作用。但是TXA2高度不稳定，会迅速被水解为较稳定的血栓烷素B2(thromboxane B2，TXB2)。TXB2随后在肝中被转化为半衰期更长的11
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脱氢血栓烷素B2(11dhTXB2)，并经尿液排出。体外血小板激活会明显影响血清TXB2的测定结果，却对血清11dhTXB2水平无影响，因而测定血液11dhTXB2的含量能更有效的反映体内TXA2的产生。
[0003]目前，已报道的11dhTXB2的检测方法有放射性免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、气相色谱
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串联质谱法(GC
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MS)和液相色谱
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串联质谱法(LC
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MS/MS)。市面上的商业化试剂盒多采用ELISA法测定，包括第一代基于多克隆抗体的ELISA试剂盒和第二代基于单克隆抗体的ELISA试剂盒，但第一代试剂盒已被停用。以上方法和试剂盒主要针对尿液样本，目前无报道使用LC
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MS/MS检测血液中的11dhTXB2。LC
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MS/MS是一种采用液相色谱分离、质谱检测的分析技术，具有高灵敏度、高特异性和高选择性的特点。采用固相萃取法可有效去除待测物干扰物并进行富集，以提高方法灵敏度。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种用于检测血液中11
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脱氢血栓烷B2的液相色谱
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串联质谱方法和试剂盒。该方法先加入酸化剂调节血液pH，孵育一段时间后，采用特异性固相萃取材料，高效富集血液中的11
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脱氢血栓烷B2(11dhTXB2)，有效去除血液中基质的干扰，实现对11
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脱氢血栓烷B2(11dhTXB2)的精准检测。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种血液中11
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脱氢血栓烷B2的精准检测试剂盒，其组成为：特异性固相萃取柱、内标液、校准液、稀释液、酸化剂、活化液、平衡液、淋洗液1和2、洗脱液和质控样本。
[0006]优选的所述特异性固相萃取柱是以硅胶为基质的含有苯基或C4～C18的正构烷基的亲和材料。
[0007]优选的所述校准液为用乙腈配制的9个浓度的溶液；其浓度范围为为0.5～100ng/mL。
[0008]优选的所述内标为11dhTxB2‑
d4，其浓度为5～50ng/mL。
[0009]优选的所述稀释液为PBS溶液。
[0010]优选的所述酸化剂为浓度为0.1～1.0mol/L盐酸水溶液。
[0011]优选的所述活化液为甲醇、乙腈或乙醇。
[0012]优选的所述平衡液、淋洗液1、淋洗液2为水和有机试剂的混合溶液，其体积比为(60～100)％：(40～0)％；所述有机试剂为甲醇、乙腈或乙醇。
[0013]优选的所述洗脱液为按体积比计含1％～10％甲酸的乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种。
[0014]一种用于检测血液中11
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脱氢血栓烷B2(11dhTxB2)的液相色谱
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串联质谱(LC
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MS/MS)
[0015]方法，包括以下步骤：
[0016](1)血液样本加入酸化剂，平衡10～30min；
[0017](2)经酸化的血液样本于25℃～45℃孵育1h～4h后，加入内标液混合；
[0018](3)特异性固相萃取柱经过活化、平衡后，加入离心好的血液样本上清液，使用淋洗液进行淋洗，最终用洗脱液洗脱并收集；
[0019](4)将步骤(3)得到的洗脱液采用液相色谱串联质谱分析，通过校准液建立的校准曲线计算血液样本中11
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脱氢血栓烷B2的含量。
[0020]优选的，步骤(4)中的色谱条件：色谱柱：Waters，Cortecs T3；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：5μL；流动相：(A)5mmol/L甲酸铵的水溶液，(B)乙腈溶液；梯度洗脱条件：
[0021][0022]质谱条件：离子化模式：ESI
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；喷雾电压：
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4500V；温度：500℃；雾化气GS1：55psi；辅助雾化气GS2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；
[0023][0024]注：*为定量离子。
[0025]本专利技术的有益效果：
[0026]1、本专利技术提供的前处理方法，孵育过程可有效将11
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脱氢血栓烷B2开环转化为闭
环形式，并去除杂质，实现对人血液11
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脱氢血栓烷B2的精准检测；
[0027]2、本专利技术提供的测定方法，操作简单可靠，分析时间短，有利于高通量测定临床样本；
[0028]3、本专利技术为首个基于液质方法的固相萃取法处理血液中11
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脱氢血栓烷B2检测试剂盒，准确度高、特异性强，检测范围宽，易于临床推广和应用。
附图说明
[0029]图1为血液中11dhTxB2和11dhTxB2‑
d4的色谱图。
具体实施方式
[0030]下面结合实例，对本专利技术做进一步说明，实例仅限于说明本专利技术，而非对本专利技术的限定。
[0031]实施例1：一种用于检测血液中11
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脱氢血栓烷B2的试剂盒。
[0032]一种用于检测血液中11
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脱氢血栓烷B2的试剂盒，其组成见下表：
[0033]名称成分固相萃取柱特异性固相萃取柱校准液乙腈配制的9个浓度的11dhTxB2的校准品稀释液PBS溶液酸化剂0.4mol/L盐酸活化液甲醇平衡液水淋洗液1水淋洗液210％甲醇洗脱液3％甲酸甲醇质控样本2个浓度的11dhTxB2血液样本内标液浓度为10ng/mL的11dhTxB2‑
d4溶液
[0034]其中，校准液中11dhTxB2浓度见下表：
[0035]序号123456789浓度ng/mL0.51248204075100
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测血液中11
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脱氢血栓烷B2(11dhTxB2)的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组成包括：特异性固相萃取柱、内标液、校准液、稀释液、酸化剂、活化液、平衡液、淋洗液1和2、洗脱液和质控样本。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述血液为血清或血浆。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性固相萃取柱是以硅胶为基质的含有苯基或C4～C18的正构烷基的亲和材料。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准液为用乙腈配制的9个不同浓度的溶液；浓度范围为0.5～100ng/mL。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标液为5～50ng/mL 11dhTxB2‑
d4。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为PBS溶液。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酸化剂为浓度0.1～1.0mol/L盐酸水溶液。8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述活化液为甲醇、乙腈或乙醇。9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述平衡液、淋洗液1、淋洗液2为水和有机试剂的混合溶液，其体积比为(60～100)％：(40～0)％；所述有机试剂为甲醇、乙腈或乙醇。10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为按体积比计含1％～10％甲酸的乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种。11.一种使用权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：张亚莲，关丽萍，崔颖，孙晓宇，潘永强，蒋玉新，曹云峰，
申请(专利权)人：大连博源医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：