【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于检验分析，具体涉及一种检测多不饱和脂肪酸在血液中浓度的方法，本专利技术还提供了应用于所述方法中的血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉及其制备方法。
技术介绍
1、必需脂肪酸指机体生命活动必不可少，但机体自身又不能合成，必须由食物供给的多不饱和脂肪酸，主要包括两种，一种是以亚麻酸为代表的ω-3系列，一种是以亚油酸为代表的ω-6系列。现代人必需脂肪酸缺乏较少出现，但极易出现ω-3/ω-6失衡，引发炎症，诱发多种疾病，如心血管疾病，神经退行性疾病和肿瘤等。在日本厚生連廣島総合病院开展脂肪酸测定项目，寻找血脂，血压和葡萄糖耐量和动脉硬化的联系指出从含有2个以上双键的脂肪酸是维持生物生命不可缺少的观点出发，必需脂肪酸的概念被提出以来，脂肪酸质的重要性被认识到。后来，通过动脉硬化症的病理病因论和预防医学研究，发现摄取脂肪酸中增加饱和脂肪酸的摄取量会促进动脉硬化。如果只单独研究血液中的浓度，可能无法正确评价病情。因此，有必要通过研究ω-6系列多不饱和脂肪酸和ω-3系列多不饱和脂肪酸在血液中的浓度比例等新方法进行研究。另外，在2021年《乳腺癌患者的营养治疗专家共识》指出：饮食中ω-3/ω-6多不饱和脂肪酸比值每增加10％，乳腺癌发病风险下降6％。人体ω-3/ω-6比值每增加10％，乳腺癌发病风险降低27％，明确机体中ω-3/ω-6多不饱和脂肪酸比值对乳腺癌的控制十分重要。
2、室内质量控制是保证检测结果准确度最重要的因素之一，由质控品绘制的质控图能够直观地监测我们实验数据的稳定性，配制的溶液型质控品其基质和正常人样本基质存在一
3、鉴于脂肪酸的临床意义，近年来，脂肪酸的检测受到大家日益关注，专利cn116858976a公开了一种高效液相色谱串联质谱检测血液中11种脂肪酸的总脂肪酸含量的方法和应用，其分析时间长:为18min，前处理时间长，需酸碱2次水解，孵育的时间约为70min；酸水解对结构复杂、空间位阻大的脂肪水解效果更好，且酸水解是可逆反应，而多不饱和脂肪酸的空间位阻小，因此，急需一种更适合多不饱和脂肪酸的方法研发。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种检测多不饱和脂肪酸在血液中浓度的方法，本专利技术还提供了一种血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉及其制备方法。
2、在一方面，提供了一种检测多不饱和脂肪酸在血液中浓度的方法，包括：
3、对待测血液样品进行预处理，得到目标样品溶液；
4、取含有多不饱和脂肪酸的血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉，用质控物复溶液进行复溶，得到多不饱和脂肪酸质控物；
5、使用高效液相色谱串联质谱对所述目标样品溶液及多不饱和脂肪酸质控物进行测试，根据标准曲线得出所述目标样品溶液中的各多不饱和脂肪酸的含量，从而得到待测的血液样品中的各多不饱和脂肪酸含量并根据多不饱和脂肪酸质控物浓度对其结果进行验证。
6、在一个实施方案中，所述血液样品是人血液样品。
7、在一个实施方案中，所述多不饱和脂肪酸包括亚麻酸ω3，二十碳五烯酸ω3，二十二碳五烯酸ω3，二十二碳六烯酸ω3，亚油酸ω6，亚麻酸ω6，二十碳三烯酸ω6，花生四烯酸ω6，二十二碳四烯酸ω6，二十二碳五烯酸ω6中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或者十种。
8、在一个实施方案中，所述血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉通过如下方法制备：收集无黄疸、乳糜、溶血的血液，分离血浆；对血浆进行滤膜过滤，先检测其中各多不饱和脂肪酸的初始浓度，然后调整浓度至质控物要求浓度，用西林瓶进行分装，经冷冻干燥，制备成血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉。
9、优选的，所述血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉的冻干曲线为，速冻阶段：-48～-52℃持续时间为2～4h；一次升华干燥阶段：-43～-47℃持续时间为2～4h，升到-30～-40℃持续时间为2-4h，升到-20～-28℃持续时间为2-4h，升到-13～-18℃持续时间为2h，升到-8～-12℃持续时间为1～2h，升到-3～-7℃持续时间为50-70min；二次升华干燥阶段：0～2℃持续时间为50-70min，升到8～13℃持续时间为1～3h,升到14～20℃持续时间为1～3h。
10、优选的，所述多不饱和脂肪酸质控物冻干曲线为，速冻阶段：-50℃持续时间为3h；一次升华干燥阶段：-45℃持续时间为3h，升到-35℃持续时间为3h，升到-25℃持续时间为3h，升到-15℃持续时间为2h，升到-10℃持续时间为1.5h，升到-5℃持续时间为1h；二次升华干燥阶段：0℃持续时间为1h，升到10℃持续时间为2h，升到15℃持续时间为2h。
11、优选的，所述质控物复溶液为水。其中，水的用量与冻干前的血浆体积相同。
12、优选的，每个西林瓶中装入50～100μl的血浆。复溶时加入同体积的水。
13、在一个实施方案中，所述血液样品进行预处理得到目标样品溶液，包括：收集待测血液样品，加入内标溶液，加入孵育剂，涡旋，孵育冷却，加入盐酸溶液，混匀，加入水不互溶有机溶剂，涡旋振荡，取上清液，氮气吹干，加入复溶液，混匀，即得到目标样品溶液。
14、优选的，所述水不互溶有机溶剂选自正己烷、环己烷中的一种或多种。
15、优选的，所述孵育剂为氢氧化钾-甲醇-乙醇-水溶液，氢氧化钾的浓度为0.35～0.68mol/l，甲醇-乙醇-水体积比为1～2:7～8:1；孵育时间为15～20min，孵育温度为80～90℃；
16、优选的，所述盐酸溶液的浓度为6～12mol/l。
17、优选的，所述复溶液为碳酸氢铵-甲醇-乙腈-水溶液，碳酸氢铵的浓度为0.02～0.05mmol/l；甲醇-乙腈-水体积比1:1:0.5～1。
18、在一个实施方案中，所述标准曲线通过如下方法绘制：
19、首先，分别配制含不同浓度的各多不饱和脂肪酸的标准曲线样本，加入内标溶液，进行预处理，即得到一系列含不同浓度的多不饱和脂肪酸的标准曲线样本溶液；
20、其次，使用高效液相色谱串联质谱对所述标准曲线样本溶液进行测试，计算各多不饱和脂肪酸和内标峰面积比值，通过内标法建立标准曲线。
21、本专利技术中，标准曲线的数量根据多不饱和脂肪酸的类型确定，有几种多不饱和脂肪酸就绘制几条标准曲线。
22、优选的，绘制标准曲线时工作液溶剂为二甲基亚砜。
23、优选的，所述内标溶液的浓度为10～20nmol/ml。
24、优选的，标准曲线样本的预处理同血液样本。
25、在一个实施方案中，血液样品或质控物或标准曲线样本与内标溶液的体积比为1：6～14，优选为1：10。
26、优选的，血液样品或质控物或标准曲线样本与孵育剂的体积比为1:100～120。
【技术保护点】
1.一种检测多不饱和脂肪酸在血液中浓度的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多不饱和脂肪酸包括亚麻酸ω3，二十碳五烯酸ω3，二十二碳五烯酸ω3，二十二碳六烯酸ω3，亚油酸ω6，亚麻酸ω6，二十碳三烯酸ω6，花生四烯酸ω6，二十二碳四烯酸ω6，二十二碳五烯酸ω6中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或者十种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉通过如下方法制备：收集无黄疸、乳糜、溶血的血液，分离血浆；对血浆进行滤膜过滤，先检测其中各多不饱和脂肪酸的初始浓度，然后调整浓度至质控物要求浓度，用西林瓶进行分装，经冷冻干燥，制备成血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉的冻干曲线为，速冻阶段：-48～-52℃持续时间为2～4h；一次升华干燥阶段：-43～-47℃持续时间为2～4h，升到-30～-40℃持续时间为2-4h，升到-20～-28℃持续时间为2-4h，升到-13～-18℃持续时间为2h，升到-8～-12℃持
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液样品进行预处理得到目标样品溶液，包括：收集待测血液样品，加入内标溶液，加入孵育剂，涡旋，孵育冷却，加入盐酸溶液，混匀，加入水不互溶有机溶剂，涡旋振荡，取上清液，氮气吹干，加入复溶液，混匀，即得到目标样品溶液；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线通过如下方法绘制：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，绘制标准曲线时工作液溶剂为二甲基亚砜；液相色谱条件为：色谱柱：Waters,ACQUITYUPLC BEH C81.7μm 2.1×100mm；柱温40℃；进样器温度4℃；流动相A为0.01％氨水-1mmol/L乙酸铵-41～43％乙腈-7～9％甲醇-水溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0～0.6min，流动相B为0％；0.6～0.7min，流动相B为0％升到4％；0.7～1.9min，流动相B为4％升到5％；1.9～2.0min，流动相B为5％升到10％；2.0～2.5min，流动相B为10％升到12％；2.5～2.6min，流动相B为12％升到25％；2.6～4.65min，流动相B为25％；4.65～4.7min，流动相B为25％降至0％；4.7～5.6min，流动相B为0％；流速为0.3mL/min；进样量1μL。
8.一种血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉的制备方法，包括：收集无黄疸、乳糜、溶血的血液，分离血浆；对血浆进行滤膜过滤，先检测其中各多不饱和脂肪酸的初始浓度，然后调整浓度至质控物要求浓度，用西林瓶进行分装，经冷冻干燥，制备成血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉，所述血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉用于权利要求1所述的检测多不饱和脂肪酸在血液中浓度的方法中。
9.一种由权利要求8所述方法制得的血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉。
10.一种血液中多不饱和脂肪酸液质联用检测时的质控物，其由权利要求9所述的血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉复溶得到。
...【技术特征摘要】
1.一种检测多不饱和脂肪酸在血液中浓度的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多不饱和脂肪酸包括亚麻酸ω3，二十碳五烯酸ω3，二十二碳五烯酸ω3，二十二碳六烯酸ω3，亚油酸ω6，亚麻酸ω6，二十碳三烯酸ω6，花生四烯酸ω6，二十二碳四烯酸ω6，二十二碳五烯酸ω6中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或者十种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉通过如下方法制备：收集无黄疸、乳糜、溶血的血液，分离血浆；对血浆进行滤膜过滤，先检测其中各多不饱和脂肪酸的初始浓度，然后调整浓度至质控物要求浓度，用西林瓶进行分装，经冷冻干燥，制备成血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述血浆型多不饱和脂肪酸冻干粉的冻干曲线为，速冻阶段：-48～-52℃持续时间为2～4h；一次升华干燥阶段：-43～-47℃持续时间为2～4h，升到-30～-40℃持续时间为2-4h，升到-20～-28℃持续时间为2-4h，升到-13～-18℃持续时间为2h，升到-8～-12℃持续时间为1～2h，升到-3～-7℃持续时间为50-70min；二次升华干燥阶段：0～2℃持续时间为50-70min，升到8～13℃持续时间为1～3h,升到14～20℃持续时间为1～3h；优选的，所述多不饱和脂肪酸质控物冻干曲线为，速冻阶段：-50℃持续时间为3h；一次升华干燥阶段：-45℃持续时间为3h，升到-35℃持续时间为3h，升到-25℃持续时间为3h，升到-15℃持续时间为2h，升到-10℃持续时间为1.5h，升到-5℃持续时间为1h；二次升华干燥阶段：0℃持续时间为1h，升到10℃持续时间为2h，升到15℃持续时间为2h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液样品进行预处理...
【专利技术属性】
技术研发人员：王璐，祝彦如，关丽萍，张亚莲，孙晓宇，
申请(专利权)人：大连博源医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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