【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及儿茶酚胺代谢物检测，具体涉及一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法和组合稳定剂及其应用。
技术介绍
1、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(pheochromocytoma andparaganglioma,ppgl)是一种少见的内分泌疾病，国内尚缺乏ppgl患病数据。国外报道在普通高血压门诊中ppgl的患病率为0.2％～0.6％，在儿童高血压患者中患病率为1.7％，在肾上腺意外瘤中约占5％。各年龄段均可发病，发病高峰为30～50岁，男女发病率基本相同。
2、甲氧基肾上腺素(mn)、甲氧基去甲肾上腺素(nmn)和3-甲氧酪胺(3-mt)是儿茶酚胺的中间代谢产物，是嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(ppgl)定性诊断的重要依据。ppgl是分别起源于肾上腺髓质或肾上腺外交感神经链的肿瘤，合成和分泌儿茶酚胺(ca)等物质，易引起患者血压升高等一系列临床症状，并造成心、脑、肾等严重并发症。mn和nmn分别是肾上腺素(e)，去甲肾上腺素(ne)的中间代谢产物(合称mns)，仅在肾上腺髓质嗜铬细胞或ppgl肿瘤体内代谢生成，并且以高浓度水平持续存在，mns的半衰期较ca更长，也更加稳定，其特异度和灵敏度高，能反映ppgl肿瘤的功能状态。2016年及2020年中华医学会内分泌学分会发表的《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗专家共识》将测定血浆和尿液中的mn及nmn作为筛查嗜铬细胞瘤的首选检测指标。3-mt是多巴胺(da)的中间代谢产物，2020版ppgl指南指出，检测3-mt可提高筛查头颈部副神经节瘤(pgl)的灵敏度；ppgl患
3、目前，检测血浆中mn、nmn及3-mt的方法中，最常用的是高效液相色谱和电化学联用检测法，但存在灵敏度低，样本需求量大，前处理时间长，组分干扰强等弊端，无法满足临床检测需求。基于免疫检测方法由于交叉反应和非特异性的结合会导致检测准确度低，且不同的免疫测试，其结果不能相互比较，故不具备普适性。液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)是一种采用液相色谱分离质谱检测的分析技术，具有高灵敏度、高特异性和高选择性的特点。已有多篇文献报道应用lc-ms/ms检测儿茶酚胺代谢物，目前报道中一般采用非衍生离子交换spe浓缩处理提取待测物，但采用该方法处理样本时，中、重度溶血样本会对待测物有不同程度的影响。此外，待测物极性大，难保留，采用非衍生法测定待测物，需要使用hilic色谱柱增强保留，但临床一些样本中含有干扰峰，难以与待测物分离，使其检测结果异常。
4、对于儿茶酚胺代谢物的准确定量，除了提高检测方法的准确度和精密度外，另一亟待解决的问题是儿茶酚胺代谢物分析前的稳定性。因为儿茶酚胺类物质多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素极易被儿茶酚氧位甲基转移酶(comt)分别代谢为3-mt、mn和nmn，导致样本中待测物含量的升高。此外儿茶酚胺代谢物的化学结构显示，其结构中带有一个酚羟基和一个带氨基的侧链，易在中性或碱性条件下被氧化成醌，导致待测物含量降低。因此，患者样本中儿茶酚胺代谢物浓度在分析前会发生不同程度的升高或降低。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法和组合稳定剂及其应用。该检测方法首先通过向采血管中添加组合稳定剂，保证分析前样本的稳定性，其次通过对样本进行衍生化并在衍生化过程中加入衍生稳定剂以提高衍生化效率，提高了检测灵敏度、特异性、检测通量及检测准确度。
2、具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本专利技术：
3、在第一个方面中，本专利技术提供了一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
4、(1)采集患者全血样本3～4ml置于含有抗凝剂的采血管中；
5、(2)向上述采血管中加入9～11μl组合稳定剂，再将采血管轻轻颠倒数次混匀；
6、(3)将步骤(2)混匀后的采血管置于3000rpm，25℃，离心分离10min，取上清液置于1.5mlep管中，得待测血浆样本；
7、(4)取步骤(3)得到的待测血浆样本置于离心管中，加入10～20μl内标工作溶液混合，再加入300～900μl沉淀剂进行蛋白沉淀，经离心分离，得上清液；
8、(5)将步骤(4)得到的上清液中依次加入5～10μl衍生稳定剂水溶液、50～200μl衍生剂的乙腈溶液及100～300μl缓冲液，混合后在温度为30～90℃进行衍生化反应，反应时间为5～30min，得到衍生化样本；
9、(6)将步骤(5)得到的衍生化样本加入经甲醇活化、去离子水平衡的固相萃取小柱中进行过柱，经淋洗、洗脱，收集洗脱液，再经离心分离，得上清液；
10、(7)将步骤(6)得到的上清液进行lc-ms/ms检测；
11、(8)将步骤(7)检测得到的待测血浆样本中儿茶酚胺代谢物峰面积与内标峰面积的比值代入到标准曲线方程中，计算得到待测血浆样本中儿茶酚胺代谢物的浓度；
12、其中，所述组合稳定剂由以下质量分数的组分组成：抗坏血酸0.5％～2％、5-羟基阿魏酸0.15％～1％、甲酸0.5～2％以及纯水，所述纯水补足至100％；
13、上述步骤(5)中所述的衍生稳定剂为l-抗坏血酸，l-抗坏血酸水溶液的浓度为0.05％～0.2％；
14、所述儿茶酚胺代谢物为甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺。
15、上述步骤(4)中：
16、所述的内标工作溶液是将甲氧基肾上腺素-d3、甲氧基去甲肾上腺素-d3及3-甲氧酪胺-d4混合后，用含0.1％～0.5％的谷胱甘肽的50％乙腈水溶液稀释制得的。
17、所述的沉淀剂为乙腈、甲醇或甲醇与乙腈的混合溶液。
18、上述步骤(5)中：
19、所述的衍生剂为丹磺酰氯，丹磺酰氯的乙腈溶液的浓度为1～10mg/ml。
20、所述的缓冲液选自na2co3-nahco3、na2hpo4-nah2po4、k2hpo4-kh2po4中的一种，ph值为8～13。
21、上述步骤(6)中：
22、所述的固相萃取小柱的填料为c8、c18。
23、所述的淋洗是用淋洗液1、2分别先后淋洗；所述的淋洗液1选自含0.1％甲酸水溶液、乙腈-水(1:9,v/v)、甲醇-水(1:9,v/v)中的一种，淋洗液1用量为100～300μl；所述的淋洗液2选自50％乙腈水溶液、乙腈、甲醇中的一种，淋洗液2用量为20～100μl。
24、所述的洗脱用的洗脱液选自含体积分数为0.1％～0.3％甲酸的甲醇、含体积分数为0.1％～0.3％甲酸的乙腈水(8:2,v/v)溶液、含体积分数为0.1％～0.3％甲酸的乙腈中的一种，洗脱液用量为100～300μl。
25、上述步骤(7)中：
26、所述液相色谱的条件为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，上述步骤(4)中：所述的内标工作溶液是将甲氧基肾上腺素-d3、甲氧基去甲肾上腺素-d3及3-甲氧酪胺-d4混合后，用含0.1％～0.5％的谷胱甘肽的50％乙腈水溶液稀释制得的；所述的沉淀剂为乙腈、甲醇或甲醇与乙腈的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，上述步骤(5)中，所述的衍生剂为丹磺酰氯，丹磺酰氯的乙腈溶液的浓度为1～10mg/mL；所述的缓冲液选自Na2CO3-NaHCO3、Na2HPO4-NaH2PO4、K2HPO4-KH2PO4中的一种，pH值为8～13。
4.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，上述步骤(6)中，所述的固相萃取小柱的填料为C8、C18；
5.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，上述步骤(7)中，所述液相色谱的
6.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，上述步骤(7)中，所述质谱参数为：离子化模式：ESI+；气帘气(CUR):30psi；碰撞气(CAD):9psi；喷雾电压(IS):5500V；温度(TEM):450℃；Gas1:60psi；Gas2:60psi；多反应检测(MRM)。
7.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，上述步骤(8)中，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
8.一种组合稳定剂，其特征在于，所述组合稳定剂由以下质量分数的组分组成：抗坏血酸0.5％～2％、5-羟基阿魏酸0.15％～1％、甲酸0.5～2％、以及纯水，所述纯水补足至100％。
9.权利要求9所述的组合稳定剂在血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测中的应用，其特征在于，所述的组合稳定剂用于稳定血浆中的儿茶酚胺代谢物。
...【技术特征摘要】
1.一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，上述步骤(4)中：所述的内标工作溶液是将甲氧基肾上腺素-d3、甲氧基去甲肾上腺素-d3及3-甲氧酪胺-d4混合后，用含0.1％～0.5％的谷胱甘肽的50％乙腈水溶液稀释制得的；所述的沉淀剂为乙腈、甲醇或甲醇与乙腈的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，上述步骤(5)中，所述的衍生剂为丹磺酰氯，丹磺酰氯的乙腈溶液的浓度为1～10mg/ml；所述的缓冲液选自na2co3-nahco3、na2hpo4-nah2po4、k2hpo4-kh2po4中的一种，ph值为8～13。
4.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，上述步骤(6)中，所述的固相萃取小柱的填料为c8、c18；
5.根据权利要求1所述的血浆中...
【专利技术属性】
技术研发人员：张亚莲，祝彦如，关丽萍，王璐，孙晓宇，
申请(专利权)人：大连博源医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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