一种基于荧光定量PCR检测人MTHFRC677T位点多态性的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR C677T位点多态性的试剂盒，属于单核苷酸多态性检测领域。本发明专利技术提供的试剂盒包含一个新的引物对和两种不同荧光标记的探针，可以快速简便地检测MTHFR C677T位点的基因型。本发明专利技术的引物和探针特异性高，结果判读简易，且操作简单，检测成本低，对5

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR C677T位点多态性的试剂盒


[0001]本专利技术属于单核苷酸多态性检测领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR C677T位点多态性的试剂盒。

技术介绍

[0002]人类基因组DNA中5,10
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亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸和甲硫氨酸在人体内代谢途径中的关键酶之一，可将5,10
‑
亚甲基四氢叶酸还原为5
‑
甲基四氢叶酸。一方面作为甲基的传递体参与体内嘌呤和嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白质的甲基化；另一方面在甲硫氨酸合成酶的催化下，以维生素B
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为辅酶，使血液中的同型半胱氨酸再甲基化生成甲硫氨酸，从而维持体内正常的同型半胱氨酸水平。
[0003]研究发现，MTHFR基因C677T位多态性可导致MTHFR的耐热性和活性下降，从而引起同型半胱氨酸甲基化受阻，出现高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸可损伤血管内皮细胞，并引起低密度脂蛋白氧化和血小板凝集，从而破坏血管平滑肌细胞的正常功能及机体的凝血和纤溶系统，从而加速动脉粥样硬化和血栓形成，引发多种疾病，如脑卒中、H型高血压、冠心病等。同时发现，高同型半胱氨酸血症可引起细胞死亡、诱导DNA链断裂、氧化应激和细胞凋亡，干扰胚胎细胞的正常周期和诱发胚胎细胞凋亡，从而引发出生缺陷的发生。
[0004]此外，MTHFR C677T基因多态性影响叶酸的正常代谢，从而增加叶酸拮抗剂的毒副作用。甲氨蝶呤是抗叶酸代谢药物，是目前很多肿瘤(急性细胞性白血病)和风湿病的一线用药，临床用药过程发现相同剂量的甲氨蝶呤用在不同的患者身上时其毒副反应不一。研究结果表明677位TT纯合子对氨甲喋呤治疗的毒性反应比677C的基因型严重得多。
[0005]另外，C677T基因多态性还影响到5
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氟尿嘧啶的化疗效果。5
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氟尿嘧啶为嘧啶类似物，属于抗代谢药的一种，对消化道癌及其他实体癌有良好疗效。5
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氟尿嘧啶对胃肠道肿瘤化疗效果的研究发现，677位TT基因型携带者化疗有效率显著高于TC和CC基因型携带者。
[0006]由此可见，通过对个体MTHFR基因C677T位点基因型进行检测可以提示个体发生脑卒中等心脑血管疾病及新生儿缺陷的风险，并预测甲氨蝶呤和5
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氟尿嘧啶等化疗药物的治疗疗效和毒副作用。
[0007]对于该突变位点的检测，目前主要有Sanger测序法、PCR
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RFLP法、芯片法、荧光定量PCR法等方法，然而上述检测方法存在检测过程繁琐，周期过长，成本较高，判读复杂或者易引起交叉污染而出现假阳性以及灵敏度低等缺点。现有技术中也公开了采用PCR
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FRET法对突变位点进行检测，通过设计一对用来扩增目标序列特异引物和一对作为目标序列的检测信号FRET探针，两个独立的特异寡核苷酸序列都标记上荧光基团。当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号，FRET探针再进行熔解曲线分析，通过熔解曲线来判断MTHFR基因多态性(C677T)。然而，上述方法需设计两条不同的FRET探针才能进行检测，检测程序复杂，且增加了检测成本。

技术实现思路

[0008]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR C677T位点多态性的试剂盒，该试剂盒采用新引物对和双标荧光探针对MTHFR C677T位点多态性进行准确检测。
[0009]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0010]本专利技术提供了一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR C677T位点多态性的试剂盒，所述试剂盒包括基于MTHFR基因C677T的SNP位点设计的特异性引物和荧光探针；其中，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团/荧光淬灭基团；
[0011]进一步的，所述特异性引物和荧光探针的序列如下：
[0012]MTHFR基因C677T正向扩增引物：GAGCTTTGAGGCTGACCTGAAG；
[0013]MTHFR基因C677T反向扩增引物：CCTCAAAGAAAAGCTGCGTGAT；
[0014]MTHFR基因677C探针：5
’
TGAAATCGGCTCCC 3
’
；
[0015]MTHFR基因677T探针：5
’
ATGAAATCGACTCCC 3
’
；
[0016]进一步的，所述MTHFR基因677C探针5
’
端的荧光报告基团为VIC，3
’
端的荧光淬灭基团为Quencher和MGB；
[0017]进一步的，所述MTHFR基因677T探针5
’
端的荧光报告基团为FAM，3
’
端的荧光淬灭基团为Quencher和MGB；
[0018]进一步的，所述试剂盒还包括如下组分中的一种或几种：PCR反应液、酶反应液、C677T位点反应液、无核酸酶水；
[0019]进一步的，所述PCR反应液包括缓冲液、MgCl2和dNTPs；所述酶反应液主要为Taq酶；
[0020]进一步的，所述C677T位点反应液包括上游引物、下游引物、677C探针、677T探针，其配比为1:1:2:1；
[0021]进一步的，所述试剂盒的使用包括如下步骤：PCR试剂准备、DNA样品提取、PCR扩增、判定样品型别；
[0022]进一步的，所述PCR扩增的循环条件如下：
[0023]60℃ 30s，收集荧光；
[0024]95℃ 10min；
[0025]95℃ 15s，60℃ 1min，收集荧光，40个循环；
[0026]60℃ 30s，收集荧光；
[0027]升温速率0.06℃/s；
[0028]进一步的，所述样品型别的判定标准如下：
[0029]若结果显示为GG型(红点)，则样品型别对应为CC型；
[0030]若结果显示为GA型(绿点)，则样品型别对应为CT型；
[0031]若结果显示为AA型(蓝点)，则样品型别对应为TT型；
[0032]若三者均不显示，则样品上样量不足或漏加，需重新加样上机。
[0033]本专利技术的有益效果在于：
[0034](1)与测序法等相比，本专利技术提供的试剂盒采用了全新引物对和双标荧光探针，具有更快的检测时效性；
[0035](3)本专利技术的试剂盒操作简便且能有效防止污染：PCR荧光检测时间(从标本处理开始)仅为2～3小时；PCR荧光检测是全封闭操作，加样后可不再打开管盖，大大避免了污染发生；
[0036](2)本专利技术提供的检测方法具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观且可节约成本等优点，在个体化代谢用药领域具有极大的应用前景。
附图说明
[0037]图1显示为本专利技术试剂盒检测23例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR C677T位点多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括基于MTHFR基因C677T的SNP位点设计的特异性引物和荧光探针；其中，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团/荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的基于荧光定量PCR检测人MTHFR C677T位点多态性的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物和荧光探针的序列如下：MTHFR基因C677T正向扩增引物：GAGCTTTGAGGCTGACCTGAAG；MTHFR基因C677T反向扩增引物：CCTCAAAGAAAAGCTGCGTGAT；MTHFR基因677C探针：5
’
TGAAATCGGCTCCC 3
’
；MTHFR基因677T探针：5
’
ATGAAATCGACTCCC 3
’
。3.根据权利要求2所述的基于荧光定量PCR检测人MTHFR C677T位点多态性的试剂盒，其特征在于，所述MTHFR基因677C探针5
’
端的荧光报告基团为VIC，3
’
端的荧光淬灭基团为Quencher和MGB。4.根据权利要求2所述的基于荧光定量PCR检测人MTHFR C677T位点多态性的试剂盒，其特征在于，所述MTHFR基因677T探针5
’
端的荧光报告基团为FAM，3
’
端的荧光淬灭基团为Quencher和MGB。5.根据权利要求1所述的基于荧光定量PCR检测人M...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤丽丽，李万帅，文诗语，何昊，孔祥宾，田应明，
申请(专利权)人：常州国药医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：