一种预测反复种植失败发生的生物标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种在辅助生殖技术中预测反复种植失败发生的生物标志物NSUN2。公开了NSUN2的表达水平或甲基化水平对反复种植失败发生的影响，发现在NSUN2过表达或过度甲基化之后，胚胎球的粘附效率显著降低。本发明专利技术的发现为胚胎的粘附、种植和着床相关疾病的预测、诊断和预后提供新的思路和理论基础。诊断和预后提供新的思路和理论基础。诊断和预后提供新的思路和理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一种预测反复种植失败发生的生物标志物及其应用


[0001]本专利技术属于子宫内膜功能检测
，具体涉及一种反复种植失败预测生物标志物及其在子宫内膜容受性检测中的应用。

技术介绍

[0002]反复种植失败(Recurrent Implantation FailureRIF)是指年龄<40岁且既往≥3次胚胎移植失败；或者≥2次胚胎移植失败，且移植的胚胎数≥4枚高评分的卵裂期胚胎(I级或II级的D3胚胎)或≥2枚高评分囊胚(Gardner囊胚评分AA/AB/BA/BB)或2枚高评分的卵裂期胚胎和1枚高评分囊胚。
[0003]妊娠是胚胎成功植入子宫内膜的结果，随后是内膜充分的蜕膜化，以及胎盘形成。这其中的每一步都需要诸多细胞因子与生理过程的参与，才能达到妊娠发育所必需的平衡。着床是功能正常的子宫内膜与囊胚之间动态相互作用的结合。着床期需要多种生理过程的参与，需要胚胎的粘附、滋养细胞的侵袭和免疫调节的稳态。成功的着床在很大程度上依赖于子宫内膜的适当结构和充分的容受性。胚胎着床率较高的时期我们称为着种植窗(Thewindow of implantationWOI)，这取决于子宫内膜的高容受性。子宫内膜容受性是许多生理和分子机制的结果，在胚胎移植过程中，识别WOI和维持子宫内膜容受性是非常重要的。
[0004]胚胎移植术后半月左右，血HCG的检测阴性提示着床失败。由于胚胎植入过程复杂，需要从多个层面对RIF的原因进行评估。虽然RIF确切的发生机制尚未完全阐明，但许多研究表明，激素水平失衡、血管生成和免疫调节因子紊乱、某些遗传多态性与RIF的发生有关。RIF的危险因素主要包括女方年龄、BMI、压力和男女方吸烟等，而其发生原因主要有胚胎因素、子宫内膜容受性和疾病等综合因素。胚胎因素包括染色体或基因异常、胚胎培养条件、透明带硬化、移植胚胎的类型与技术。子宫内膜容受性的影响因素主要包括免疫因素、感染因素、相关细胞分子的表达以及宫腔异常等。现有的研究发现细胞免疫中的NK细胞和T细胞；白介素家族的IL1a、IL1b、IL6、IL15；白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)血管内皮生长因子VEGF；同源框基因A10(HOXA10)；叉头转录因子FOXO1、KLF12；克劳丁家族蛋白4(CLDN4)等参与了RIF发生机制的调控。
[0005]RNA甲基化是RNA常见的化学修饰方式之一，属于表观遗传学的范畴，近年来的研究发现RNA甲基化参与了多种生物学功能的调控，与多种疾病的发病机制相关。目前研究较多的是m6A(N6
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methyladenosine，6
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甲基腺嘌呤)和m5C(5
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methylcytosine，5
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甲基胞嘧啶)。m5C广泛存在于各种RNA中，包括胞质和线粒体核糖体RNA(cytoplasmic and mitochondrial ribosomal RNA)和转运RNA(transfer RNA,tRNA)，以及信使RNA(mRNA)、增强子RNA(enhancer RNAs,eRNA)和许多非编码RNA(ncRNA)。在真核生物中，m5C甲基化是由NOL1/NOP2/SUN结构域(NSUN)家族的酶(NSUN1
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7)以及DNA甲基转移酶同源物DNMT2催化的。近年来，大量研究揭示了m5C在RNA加工中的多种分子功能，如mRNA的输出、RNA的稳定性，翻译以及植物RNA的长距离运输。此外，RNA的m5C修饰在线粒体活性、应激反应、配子发生和胚
胎发生、神经和大脑发育，以及多种肿瘤的发生和迁移中也起着重要的调控作用。
[0006]综上可见，目前仍然没有确切的指标能够预测反复种植失败的发生。因此，急需一种能够准确预测反复种植失败发生的标志物，为反复种植失败发生的诊断及治疗提供理论依据。

技术实现思路

[0007]针对上述问题，专利技术人经过多角度研究发现，NSUN2表达水平上升引起胚胎粘附水平下降，NSUN2可作为生物标志物预测反复种植失败的发生。
[0008]具体地，本专利技术第一方面提供了NSUN2基因或蛋白作为生物标志物在制备用于反复种植失败(RIF)、胚胎着床失败风险预测和/或子宫内膜容受性评估试剂中的用途。
[0009]本专利技术第二方面提供了NSUN2基因或蛋白的检测试剂在制备用于反复种植失败(RIF)、胚胎着床失败风险预测和/或子宫内膜容受性评估试剂盒中的用途。
[0010]在某些实施方式中，所述试剂通过实时荧光定量PCR和高通量测序中的一种或几种方法的组合对所述基因的转录水平进行检测。
[0011]优选地，所述NSUN2基因的检测试剂包括用于NSUN2实时荧光定量PCR检测的引物和/或探针；更优选地，所述NSUN2实时荧光定量PCR检测的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：1(ACCTGGCTCAAAGACCACACAG)和SEQ ID NO：2(TGGCTTGATGGACGAGCAGGTA)所示。
[0012]在某些实施方式中，所述试剂通过BCA蛋白定量、免疫组化法、蛋白免疫印迹和ELISA中的一种或几种方法的组合对所述蛋白的水平进行检测。
[0013]优选地，所述NSUN2蛋白的检测试剂包括NSUN2特异性抗体。
[0014]在某些实施方式中，所述试剂通过高通量测序对所述基因的甲基化水平进行检测。
[0015]在某些实施方式中，所述试剂盒的检测样本为RIF患者的子宫内膜组织；优选地，为胚胎种植窗期的子宫内膜组织。
[0016]本专利技术第三方面提供了一种反复种植失败(RIF)、胚胎着床失败风险预测和/或子宫内膜容受性评估试剂盒，所述试剂盒包括：检测NSUN2基因转录水平的试剂、检测NSUN2基因甲基化水平的试剂和/或检测NSUN2蛋白水平的试剂。
[0017]本专利技术第四方面提供了一种非疾病诊断和治疗目的评估子宫内膜组织样本中内膜容受性的方法，所述方法包括对组织中NSUN2基因转录水平、NSUN2基因甲基化水平和/或NSUN2蛋白水平进行检测；以反复种植失败或者胚胎着床失败的患者的NSUN2的转录水平、NSUN2基因甲基化水平或NSUN2蛋白水平数值作为对照；NSUN2基因转录水平、NSUN2基因甲基化水平和/或NSUN2蛋白高于对照指示子宫内膜组织内膜容受性较差。
[0018]本专利技术第五方面提供了一种用于反复种植失败(RIF)、胚胎着床失败风险预测、和/或子宫内膜容受性评估的系统，包括：1)试剂，用于检测NSUN2的转录水平、NSUN2甲基化水平和/或NSUN2蛋白水平的检测；2)装置，包括数据输入模块、数据比较模块和结论输出模块。
[0019]在某些实施方式中，所述数据输入模块用于输入待测样本中NSUN2的转录水平值。
[0020]在某些实施方式中，所述数据比较模块用于待测样本NSUN2的转录水平值与对照数值进行比较；所述对照数值为反复种植失败或者本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.NSUN2基因或蛋白作为生物标志物在制备用于反复种植失败(RIF)、胚胎着床失败风险预测和/或子宫内膜容受性评估试剂中的用途。2.NSUN2基因或蛋白的检测试剂在制备用于反复种植失败(RIF)、胚胎着床失败风险预测和/或子宫内膜容受性评估试剂盒中的用途。3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述试剂通过实时荧光定量PCR和高通量测序中的一种或几种方法的组合对所述基因的转录水平进行检测；优选地，所述NSUN2基因的检测试剂包括用于NSUN2实时荧光定量PCR检测的引物和/或探针；更优选地，所述NSUN2实时荧光定量PCR检测的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：1(ACCTGGCTCAAAGACCACACAG)和SEQ ID NO：2(TGGCTTGATGGACGAGCAGGTA)所示。4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述试剂通过BCA蛋白定量、免疫组化法、蛋白免疫印迹和ELISA中的一种或几种方法的组合对所述蛋白的水平进行检测；优选地，所述NSUN2蛋白的检测试剂包括NSUN2特异性抗体。5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述试剂通过高通量测序对所述基因的甲基化水平进行检测。6.根据权利要求1
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5任一项所述的用途，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为RIF患者的子宫内膜组织；优选地，为胚胎种植窗期的子宫内膜组织。7.一种反复种植失败(RIF)、胚胎着床失败风险预测和/或子宫内膜容受性评估试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄伯贤，陆嘉逢，郭灵，李红，刘振兴，钱春凤，
申请(专利权)人：苏州市立医院，
类型：发明
国别省市：