一种用于高通量表征生物分子种类和数量的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于高通量表征样本中生物分子(包括膜蛋白、脂质、糖基化分子和分泌物等)种类和数量的方法及其应用。其原理是利用DNA核酸适体良好的靶标特异性、碱基序列的独特性以及可被直接测序检测的特点，通过对其偶联适配商业化单细胞建库平台的捕获序列，从而构建为一种区别于目前抗体

【技术实现步骤摘要】
一种用于高通量表征生物分子种类和数量的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，涉及一种用于高通量表征生物分子种类和数量的方法及其应用。

技术介绍

[0002]细胞膜在细胞生长、分化、细胞间通讯和免疫细胞应答等生命活动中发挥着至关重要的作用，是细胞结构的主要组成部分。许多细胞膜相关的生物分子与包括恶性肿瘤在内的许多重大疾病的发生发展密切相关，是临床中进行诊断和治疗的重要生物标志物。因此，细胞膜相关生物分子的检测具有极大的基础科学和临床指导价值。以膜蛋白为例，目前针对生物样本中膜蛋白表征的常规技术手段有：蛋白印迹法、免疫组化染色和流式细胞术等。然而这些方法能够同时检测的膜蛋白种类非常有限，无法同时进行几十种、甚至上百种膜蛋白的高通量表征，难以应对许多珍贵生物样本，尤其是临床样本的检测需求。
[0003]随着近年来DNA条形码领域的发展，以Ab
‑
Seq(Shahi P,Kim SC,Haliburton JR,Gartner ZJ,Abate AR.Sci Rep.2017,14,44447.)、CITE
‑
seq(Stoeckius M,Hafemeister C,Stephenson W,Houck
‑
Loomis B,Chattopadhyay PK,Swerdlow H,Satija R,Smibert P.Nat Methods.2017,14,865)和REAP
‑
seq(Peterson VM,Zhang KX,Kumar N,Wong J,Li L,Wilson DC,Moore R,McClanahan TK,Sadekova S,Klappenbach JA.Nat Biotechnol.2017,35,936)等为首的新技术通过寡核苷酸序列变换对探针种类进行编码，并利用基因测序平台对序列进行读取和解码，突破了传统膜蛋白表征手段的通量极限，将膜蛋白定量带入了单细胞、高通量的时代。这些现有技术均采用抗体作为特异性识别靶头，通过共价或非共价的方式耦合单链寡核苷酸的编码片段，构建针对膜蛋白的分子探针。然而，抗体的空间位阻通常较大，在检测邻近膜蛋白时容易产生竞争干扰，对定量表征的准确性存在潜在影响。此外，抗体的筛选流程复杂，纯化难，极大提高了检测成本，并且抗体与寡核苷酸的偶联技术工艺较为复杂，批次效应强，进一步增加了探针构建的复杂性。更重要的是，现有技术无法有效表征除膜蛋白外其他生物分子(例如，脂质、糖类和代谢物)的状态，从而缺乏对细胞翻译后修饰及代谢活性相关信息的获取。
[0004]相比之下，核酸适体不仅具有与抗体类似的靶标特异性，并且是一段具有独特碱基序列的单链寡核苷酸，本身即可以作为DNA条形码，因此从功能上可以替代抗体
‑
寡核苷酸偶联物。核酸适体同时还具有筛选简便，可大批量制备及合成成本低等技术优势。核酸适体的靶标不仅囊括膜蛋白，还包括脂质、糖基化分子、细胞分泌物等，可以更加全面地揭示细胞膜相关的分子信息。然而，目前基于核酸适体来高通量定量表征生物分子的技术仍然尚未出现。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术存在的问题，本专利技术的构建了一种基于DNA核酸适体的生物分子探针，并将其应用于细胞系及复杂生物样本中生物分子的高通量定量表征。相比基于抗体
‑
寡核苷酸偶联物的检测技术，本方法具有探针结构简单、设计容易、合成成本低等技术优点，适用于推广应用。
[0006]第一方面，本专利技术提供一种基于核酸适体的高通量表征的探针，
[0007]所述探针具有如下通式序列结构：
[0008]5’‑
定位/识别靶标的核酸适体序列
‑
(N)
x
‑
被测序系统识别的捕获序列
‑3’
；
[0009]其中，每个N独立地选自A、T、C、G四种脱氧核糖核苷酸中的任意一种，x表示N的数量，x选自0
‑
20任一自然数。
[0010]在一些技术方案中，x独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；
[0011]优选地，x选自0时，所述探针具有如下序列结构：
[0012]5’‑
定位/识别靶标的核酸适体序列
‑
被测序系统识别的捕获序列
‑3’
。
[0013]在一些技术方案中，定位/识别靶标的核酸适体序列为定位/识别生物分子的核酸适体序列，优选为定位/识别膜蛋白的核酸适体序列，更优选为序列SEQ IDNo.70
‑
138任一所示的核酸适体序列。
[0014]在一些技术方案中，被测序系统识别的捕获序列独立地选自以下捕获序列1
‑
3中的任意一种：
[0015]捕获序列1：5
’‑
AAAAAAAAAAAAAAA(A)
y
‑3’
，
[0016]捕获序列2：5
’‑
GCTCACCTATTAGCGGCTAAGG
‑3’
，
[0017]捕获序列3：5
’‑
GCTTTAAGGCCGGTCCTAGCAA
‑3’
，
[0018]其中，y代表A的数量，y选自0
‑
16任一自然数。
[0019]在一些技术方案中，y独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。
[0020]在一些技术方案中，被测序系统识别的捕获序列选自捕获序列1：
[0021]捕获序列1：5
’‑
AAAAAAAAAAAAAAA(A)
y
‑3’
，
[0022]其中，y代表A的数量，y选自0
‑
16任一自然数。
[0023]在一些技术方案中，y独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。
[0024]在一些技术方案中，所述探针的序列选自SEQ NO.1
‑
NO.69所示的任一序列。
[0025]在一些技术方案中，所述探针用于生物样本中生物分子的高通量表征。
[0026]在一些技术方案中，所述生物分子包括膜蛋白、脂质、糖基化分子、细胞分泌物和代谢物；优选地，所述生物分子是膜蛋白；
[0027]和/或，所述生物样本选自细胞系样本、新鲜组织样本；优选地，所述生物样本是人三阴型乳腺癌SUM149细胞或人三阴型乳腺癌组织样本。
[0028]第二方面，本专利技术提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括上述基于核酸适体的高通量表征的探针。
[0029]第三方面，本专利技术提供上述基于核酸适体的高通量表征探针或上述试剂盒进行高通量表征的方法，包括以下步骤：
[0030](1)探针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适体的高通量表征的探针，其特征在于，所述探针具有如下通式序列结构：5
’‑
定位/识别靶标的核酸适体序列
‑
(N)
x
‑
被测序系统识别的捕获序列
‑3’
；其中，每个N独立地选自A、T、C、G四种脱氧核糖核苷酸中的任意一种，x表示N的数量，x选自0
‑
20任一自然数。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，x选自0时，所述探针具有如下序列结构：5
’‑
定位/识别靶标的核酸适体序列
‑
被测序系统识别的捕获序列
‑3’
。3.根据权利要求1
‑
2任一项中所述的探针，其特征在于，定位/识别靶标的核酸适体序列为定位/识别生物分子的核酸适体序列，优选为定位/识别膜蛋白的核酸适体序列，更优选为序列SEQ ID No.70
‑
138任一所示的核酸适体序列。4.根据权利要求1
‑
3任一项中所述的探针，其特征在于，被测序系统识别的捕获序列独立地选自以下捕获序列1
‑
3中的任意一种：捕获序列1：5
’‑
AAAAAAAAAAAAAAA(A)
y
‑3’
，捕获序列2：5
’‑
GCTCACCTATTAGCGGCTAAGG
‑3’
，捕获序列3：5
’‑
GCTTTAAGGCCGGTCCTAGCAA
‑3’
，其中，y代表A的数量，y选自0
‑
16任一自然数；优选地，被测序系统识别的捕获序列选自捕获序列1：捕获序列1：5
’‑
AAAAAAAAAAAAAAA(A)
y
‑3’
，其中，y代表A的数量，y选自0
‑
16任一自然数。5.根据权利要求1
‑
4任一项中所述的探针，其特征在于，所述探针的序列选自SEQ NO.1
‑
NO.69所示的任一序列。6.根据权利要求1
‑
5任一项中所述的探针，其特征在于，所述探针用于生物样本中生物分子的高通量表征。7.根据权利要求6所述的探针，其特征在于，所述生物分子包括膜蛋白、脂质、糖基化分子、细胞分泌物和代谢物；优选地，所述生物分子是膜蛋白；和/或，所述生物样本选自细胞系样本、新鲜组织样本；优选地，所述生物样本是人三...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭蔚泓，吴芩，贾浩然，费立言，张克兢，陈敏，符婷，甘绍举，
申请(专利权)人：中国科学院基础医学与肿瘤研究所筹，
类型：发明
国别省市：