【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种高hla结合力的肿瘤新抗原肽的筛选方法及新抗原疫苗抗癌应用方法
技术介绍
1、结直肠癌(crc)位居恶性肿瘤发病率前列，晚期患者的5年生存率低于20％。既往的晚期一线治疗方式是化疗联合抗血管内皮生长因子(vegf)或抗表皮生长因子受体(egfr)抗体，但大多数患者在1年内病情进展迅速。le等发现具有错配修复基因缺陷(dmmr)或高度微卫星不稳定(msi-h)分子表型的晚期crc能从免疫检查点抑制剂——程序性死亡受体(pd-1)单抗pembrolizumab免疫治疗中显著获益，因此开启了crc免疫治疗时代。然而，抗pd-1单抗的临床疗效及应用被高发的耐药所限制，大部分肿瘤治疗后的缓解率(orr)不超过40％。脾胃湿热证和脾气亏虚证是晚期结直肠癌患者最常见的两种中医证型，且各具不同的免疫特征，目前尚缺乏创造性地研究肿瘤新抗原肽对上述两种中医证型的免疫治疗耐药晚期结直肠癌的各异的抗肿瘤免疫作用。
2、癌症基因组的不稳定性导致突变的积累，这些突变可产生使t细胞免疫耐受豁免的肿瘤特异性新抗原。这些新抗原被认为是t细胞抗肿瘤免疫应答和个体化肿瘤免疫治疗策略的最佳靶点。目前已被证实肿瘤新生抗原可以触发有效的t细胞免疫应答。ott等揭示了接种肿瘤新抗原可以扩大先前存在特异性t细胞抗原受体库，在肿瘤患者体内产生更多新抗原诱导的特异性t细胞免疫应答，从而有助于肿瘤的控制。人类白细胞抗原(hla)分子在抗肿瘤t细胞免疫应答中起着重要作用，可向细胞毒性t淋巴细胞(ctl)呈递抗原。但预测得到的肿瘤特异性抗
技术实现思路
1、为解决现有技术存在的问题或缺陷，本专利技术提出了一种高hla结合力的肿瘤新抗原肽的筛选方法及新抗原疫苗抗癌应用方法，本专利技术拟通过虚拟筛选手段结合常用t细胞抗原表位预测方法，发现hla-a*24:02结合抗原的锚定残基的相关特征参数。并且本申请能够基于晚期免疫治疗耐药的结直肠癌患者的基因分析，结合本专利技术中的特征参数及结直肠癌高频突变基因参数，筛选得到高频且高hla-a*24:02结合力的肿瘤新抗原，联合甘露寡糖作为佐剂，组成新抗原疫苗，增强和扩展抗肿瘤特异性免疫效应。本专利技术经体外特异性ctl细胞活化试验验证新抗原疫苗杀灭肿瘤细胞的有效性，并采用转录组测序以发现相关作用机制。
2、为了实现上述目的，本专利技术发现并提出高hla-a*24:02结合力的抗原的锚定残基的相关特征参数，包括如下步骤：
3、s1、将来源于人乳头瘤病毒(hpv)e6、e7蛋白的具有hla-a*24:02亲和力的多肽cyslygttl和hynivtfcc的锚点残基第2位和第9位分别行位点扫描(positionalscanning)，并保存为pdb格式；后加载至autodock软件，添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键均默认可旋转，保存为pdbqt格式，作为对接配体；
4、s2、使用pymol删除hla-a*2402晶体结构(pdb id：7jyv)中的结晶水和其他小分子，加氢，转换为pdb格式；后载入autodock软件，添加原子电荷，分配原子类型，保存为pdbqt格式，作为对接受体；
5、s3、采用autodock vina1.1.2对多肽与hla进行分子对接，exhaustiveness参数设置为32，其他参数默认；设置对接盒子，完全包裹hla结合凹槽；选择打分最高的构象，作为对接构象，后续进行分子动力学模拟；
6、s4、采用amber18软件包，设置参数如下：多肽和hla分子均使用ff14sb力场参数；载入tleap模块；自动加氢和拮抗离子na+以中和电荷；选择tip3p显性水模型，设置周期性边界条件，水盒子边界离分子最近距离不低于1nm；
7、s5、步骤s4中，首先通过约束蛋白和多肽的重原子，将水分子进行10000步(含5000步最速下降法和5000步共轭梯度法)能量最小化；随后，放开约束，将整个体系进行10000步能量最小化(含5000步最速下降法和5000步共轭梯度法)；能量最小化结束后，在50ps时间内，将体系缓慢加热至300k；加热完成后，在npt系综下(保证体系的原子数量n、压强p和温度t保持不变)对体系进行50ps的平衡；最后将体系在npt系综下进行50ns的分子动力学模拟，时间步长2fs；每隔10ps保存一次轨迹数据，并用cpptraj模块进行相关分析。配体和蛋白的结合自由能计算则采用mmpbsa.py模块进行，以hla作为受体(r)，多肽作为配体(l)进行计算；
8、s6、对步骤s5中得到的数据进行数据收集；
9、s7、分别对锚定残基行位点扫描后的抗原与hla间的亲和力和稳定性进行预测；
10、s8、步骤s7中预测的结果采用spss软件进行统计学分析；若指标数据符合正态性检验和方差齐性检验，则使用方差分析；否则使用非参数检验；使用pearson相关系数表示相关关系的强弱情况，当p值＜0.05时被认为差异具有统计学意义。
11、优选的，所述hla与抗原具体为hla-a*24:02等位基因型和来源于hpv基因组保守区域e6和e7的抗原九肽cyslygttl和hynivtfcc，九肽序列来源于文献(bonsack m,etal.cancer immunol res.2019may；7(5):719-736.doi:10.1158/2326-6066.cir-18-0584.)；
12、hla-a*2402晶体结构(pdb id:7jyv)来源于rcsb数据库(https://www.rcsb.org/structure/7jyv)。
13、优本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，所述HLA与抗原具体为HLA-A*24:02等位基因型和来源于HPV基因组保守区域E6和E7的抗原九肽CYSLYGTTL和HYNIVTFCC；HLA-A*2402晶体结构(PDB ID:7JYV)来源于RCSB数据库。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，步骤S1中多肽结构由rosetta产生，使用pymol检查结构，转换为pdb格式。
4.根据权利要求1所述的一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，步骤S6中所述数据收集的具体方法为：采用薛定谔软件进行多肽-HLA的界面分析；进一步载入复合物，将peptide识别为配体，将HLA识别为受体；随后选择task菜单中的protein interactionanalysis进行分析，导出csv格式文件。
5.根据权利要求1所述的一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，步骤S7中抗原与HLA的亲和力和稳定性分别采用NetMHCpan和Net
6.一种新抗原疫苗抗癌应用方法，基于权利要求1-5中任意一项所述的肿瘤新抗原肽的筛选方法筛选验证得到的新抗原肽疫苗，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的一种新抗原疫苗抗癌应用方法，其特征在于，所述步骤s1中样本收集的方法为：纳入脾胃湿热证和脾气亏虚证晚期PD-1单抗耐药结直肠癌患者各30例；所述基因检测的方法为：收集所述60例患者肿瘤组织石蜡切片10片和静脉血5ml，委托专业医疗科技中心进行全基因组二代测序；将全外显子序列与hg19基因组进行比对：检测体细胞突变和基因组扩增/缺失、单核苷酸变异、插入-缺失多态性以及HLA等位基因型。
8.根据权利要求7所述的一种新抗原疫苗抗癌应用方法，其特征在于，所述步骤s2中对新抗原的效果进行预测的方法为：
9.根据权利要求8所述的一种新抗原疫苗抗癌应用方法，其特征在于，所述步骤s3中制备新抗原疫苗特异性CTL细胞的方法为：
10.根据权利要求9所述的一种新抗原疫苗抗癌应用方法，其特征在于，所述步骤s4中分析新抗原疫苗的体外抗癌作用及机制的方法为：
...【技术特征摘要】
1.一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，所述hla与抗原具体为hla-a*24:02等位基因型和来源于hpv基因组保守区域e6和e7的抗原九肽cyslygttl和hynivtfcc；hla-a*2402晶体结构(pdb id:7jyv)来源于rcsb数据库。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，步骤s1中多肽结构由rosetta产生，使用pymol检查结构，转换为pdb格式。
4.根据权利要求1所述的一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，步骤s6中所述数据收集的具体方法为：采用薛定谔软件进行多肽-hla的界面分析；进一步载入复合物，将peptide识别为配体，将hla识别为受体；随后选择task菜单中的protein interactionanalysis进行分析，导出csv格式文件。
5.根据权利要求1所述的一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，步骤s7中抗原与hla的亲和力和稳定性分别采用netmhcpan和netm...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱影，姚庆华，
申请(专利权)人：中国科学院基础医学与肿瘤研究所筹，
类型：发明
国别省市：
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