一种肺炎克雷伯菌的重组蛋白MrkD及其作为疫苗抗原的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种肺炎克雷伯菌的重组蛋白MrkD，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示，本发明专利技术还提供了上所述抗原蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还公开该重组蛋白MrkD在制备用于诊断或防治肺炎克雷伯菌感染的药物中的应用。采用本发明专利技术提供的重组蛋白可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答。液免疫应答。液免疫应答。

【技术实现步骤摘要】
一种肺炎克雷伯菌的重组蛋白MrkD及其作为疫苗抗原的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种肺炎克雷伯菌的重组蛋白MrkD及其作为疫苗抗原的应用。

技术介绍

[0002]肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae，KP)常定植于人体肠道和呼吸道，是临床上常见的条件致病菌之一(Martin RM,Bachman MA.Front Cell Infect Microbiol,2018)，其可在全身各部位导致感染发生，常见于老年患者、营养不良、慢性酒精中毒、慢性疾病和全身衰竭的患者，可引起肺炎、尿路感染、脑膜炎、全身败血症等全身或局部感染，严重时危及患者生命安全(Akova M,Daikos GL，Tzouvelekis L，et al.Clin Microbiol Infect,2012)。近年来，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)在临床上检出率逐年增加，因其超强的耐药性和致病性被称为“超级细菌之王”，给临床治疗制造巨大的阻碍，因此也成为目前研究关注的热点(Munoz
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Price LS,Poirel L,Bonomo RA，et al.Lancet Infect Dis,2013)(Hu F，Zhu D,Wang F.et al.Clin Infect Dis，2018)。有研究表明，对碳青霉烯类抗菌药物敏感的KP感染致死率为20％～30％，而CRKP感染致死率可达40％～70％(Iredell J，Brown J，Tagg K.mechanisms and clinical implications.BMJ.2016)(Nordmann P，Cuzon G，Naas T.Lancet Infect Dis.2009)，严重威胁人类健康，考虑到其日益严峻的耐药形势，研发新的防治手段迫在眉睫。疫苗接种能有效保护机体免受细菌侵害，并且不受抗生素耐药机制的影响，是一种非常有潜力的防治手段。
[0003]肺炎克雷伯菌的灭活疫苗由于安全性有限，当前没有获批上市的相关药物产品。随着免疫学、分子生物学、纳米科学等学科的不断发展，细菌疫苗的类型、组成都发生了很大变化，出现了多糖疫苗、多糖结合疫苗、蛋白疫苗、纳米疫苗等新型疫苗(Hackett RJ,Marcus S.Infect Immun,1970)。全菌及灭活疫苗发挥作用的组分较为复杂且安全性较低，单纯的多糖组分免疫原性较差，可通过与其他组分如载体蛋白结合来提高免疫效果。重组亚单位疫苗是很有前景的疫苗类型。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过反向疫苗学的方法，对肺炎克雷伯菌全基因组进行分析，筛选出潜在的抗原决定簇，对其进行高通量的克隆、表达、纯化，并在动物体内进行保护性评价，从而筛选出了150多种具有保护性的候选抗原，并对其中42种候选抗原进行动物体内保护性评价，从而筛选出了一系列具有保护性的候选抗原。其中，筛选出MrkD蛋白为菌毛粘附蛋白，与细菌毒力相关，研究结果表明：mrkD基因阳性率为94％，与其他测试基因rmpA、Irp
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1和magA基因相比更丰富(Ahmadi M et al.,Expert Rev Anti Infect Ther.2022)。将上述MrkD抗原蛋白表达纯化后与氢氧化铝作为佐剂制备疫苗，免疫BALB/C小鼠，在多次动物攻毒保护实验中疫苗保护率在50％左右，体现出较好的保护效果，同时，能够诱导高效的体液免疫应答，可作为有效的疫苗候选抗原组分。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用作肺炎克雷伯菌抗原的重组蛋白MrkD，其氨基酸酸序列为SEQ ID NO:2。
[0006]本专利技术还提供了上述的重组蛋白MrkD的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
[0007]本专利技术进一步提供了一种表达载体，其包含骨架质粒和上述的编码基因。
[0008]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述编码基因的一端连接蛋白纯化标签的编码序列；所述蛋白纯化标签选自HIS、GST、MBP、NusA或SUMO中的任一种；优选为组氨酸标签(HIS)。通过在蛋白两端引入HIS标签序列以方便后续产业化纯化。
[0009]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述骨架质粒选自pGEX系列载体、pET系列载体或pQE系列载体中的任一种；优选为pET30a质粒。采用原核表达质粒pET30a来构建重组表达质粒，该载体具有卡那霉素抗性，可用于阳性克隆的筛选。
[0010]在根据本专利技术的一个实施方案中，核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
[0011]本专利技术进一步提供了一种重组工程菌，其含有上述的表达载体。
[0012]在根据本专利技术的一个实施方案中，宿主菌为大肠杆菌XL1
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blue菌株、BL21系列菌株或HMS174系列菌株，优选为大肠杆菌BL21菌株。
[0013]本专利技术还提供一种用作肺炎克雷伯菌抗原的重组蛋白MrkD的纯化方法。主要技术方案是：收集表达该重组蛋白的基因工程菌；按照高压破菌、离心；离子交换；酶切的顺序组合对重组蛋白进行纯化。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。
[0014]本专利技术的再一方面提供了上述的重组蛋白MrkD在制备用于诊断、预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的制剂中的应用；优选地，所述制剂还包含药学上可接受的佐剂，更优选地，所述佐剂选自佐剂氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和分枝杆菌卡介苗佐剂中的任一种。
[0015]本专利技术还进一步提供了一种用于预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的亚单位疫苗，其含有上述的重组蛋白MrkD；优选地，还包含药学上可接受的佐剂，更优选地，所述佐剂选自佐剂氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和分枝杆菌卡介苗佐剂中的任一种。
[0016]本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：
[0017]1)重组蛋白MrkD表达质粒在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达。
[0018]2)选择pET30a载体时，重组蛋白以融合蛋白形式表达；所表达的重组蛋白C端含有一个组氨酸标签，使得纯化条件简单，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；纯化出来的重组蛋白纯度大于90％。
[0019]3)利用本专利技术重组蛋白MrkD制备的疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体。并经动物实验证实，所述基因工程重组蛋白疫苗具有良好的抗KP感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
附图说明
[0020]图1：重组质粒pET30a
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MrkD的双酶切鉴定结果图；其中，
[0021]泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、
1200、800、500、200bp本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肺炎克雷伯菌的重组蛋白MrkD，其氨基酸酸序列为SEQ ID NO:2。2.如权利要求1所述的重组蛋白MrkD的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。3.一种表达载体，其特征在于，包含骨架质粒和如权利要求2所述的编码基因。4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述编码基因的一端连接蛋白纯化标签的编码序列；所述蛋白纯化标签选自HIS、GST、MBP、NusA或SUMO中的任一种；优选为HIS。5.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述骨架质粒选自pGEX系列载体、pET系列载体或pQE系列载体中的任一种；优选为pET30a质粒。6.如权利要求3
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5中任一项所述的表达载体，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:3。7.一种重组工程菌，其特征在于，含有如权利要求3
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4中任一项所述的表达载体。...

【专利技术属性】
技术研发人员：敬海明，袁月，章金勇，张晓丽，陈致富，苟强，赵卓，邹全明，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：