具有荧光素酶活性的重组细胞及其构建方法与所用重组载体技术

本发明专利技术公开了具有荧光素酶活性的重组细胞及其构建方法与所用重组载体。本发明专利技术涉及生化技术领域，本发明专利技术提供了含有如下重组载体的重组细胞，其中重组载体为含有荧光素酶基因表达盒，荧光素酶基因表达盒是包含荧光素酶基因及所述荧光素酶基因表达所需的调控序列的双链DNA分子，且荧光素酶基因的核苷酸序列是序列1的第727

【技术实现步骤摘要】
具有荧光素酶活性的重组细胞及其构建方法与所用重组载体


[0001]本专利技术涉及生化
，具体涉及具有荧光素酶活性的重组细胞及其构建方法与所用重组载体。

技术介绍

[0002]获得性免疫缺陷综合征(Acquired immune deficiency syndrome,AIDS)即艾滋病，是由于人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的极具危害性的传染性疾病，可通过直接的体液接触而传染给其他人群。
[0003]自从1983年分离出HIV
‑
1，就发现其具有高度的基因多态性。通过对病毒基因序列的分析，发现在进化树上欧洲/北美地区的序列与非洲地区的序列分开形成不同的进化簇，据此将HIV
‑
1分为欧洲/北美株和非洲株。此后，随着序列的积累，发现在进化树上病毒的env序列存在多个彼此间几乎等距的进化支，1992年将这些进化支命名为A、B、C、D、E、F基因型，此前的欧洲/北美株被称为B亚型。1998年提出HIV
‑
1流行重组体(Circulating recombinant forms，CRF)的概念，指出它是已流行的HIV
‑
1重组毒株，判断标准是至少测定了2个毒株的全长基因组序列；测序的毒株具有相同的基因组结构并与已知的不同；至少在2个没有流行病学联系的个体发现了该病毒。满足这些标准的当时有4个重组毒株(A/E、A/G、A/G/I和A/B)，CRF55_01B起源于2000
‑<br/>2003年左右，CRF55_01B毒株是我国第一株CRF01_AE和B亚型的重组毒株，CRF55_01B在同年发现的CRF01_AE和B亚型重组菌株(CRF59_01B，CRF67_01B，CRF68_01B)以及许多在MSMs中发现的新CRF(CRF79_0107，CRF80_0107等)中脱颖而出，成为中国第五大最普遍的HIV
‑
1毒株。
[0004]HIV
‑
1通过两端长末端重复序列(long terminal repeated，LTR)的结构将原病毒DNA借助整合酶的作用整合到宿主的基因组DNA中。
[0005]HIV难以根治的主要原因是存在于患者体内的HIV潜伏储存库。一部分HIV感染宿主CD4
+T
细胞整合了HIV前病毒DNA后，细胞从活化状态逆转为静息的状态，HIV前病毒DNA沉默在这些细胞中，形成一种半衰期长但转录沉默的前病毒。这部分感染HIV的细胞并不会表达HIV相关物质，从而产生免疫逃逸现象，同时逃脱抗逆转录病毒药物的杀灭。稳定整合的HIV前病毒DNA成为了宿主细胞的遗传物质的一部分，只有当刺激信号出现，才会重新启动转录，成为新的感染源。
[0006]目前，对于如何形成HIV潜伏感染的机制尚不明确，研究发现，转录抑制对于HIV潜伏期的建立和维持至关重要，而HIV潜伏库是根除HIV的最大障碍。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的问题为如何激活HIV潜伏储存库的转录抑制。
[0008]为了解决以上问题，本专利技术提供了一种含有重组载体的重组细胞。
[0009]本专利技术提供的重组细胞中，所述重组载体为含有荧光素酶基因表达盒，所述荧光素酶基因表达盒是包含荧光素酶基因及所述荧光素酶基因表达所需的调控序列的双链DNA
分子，所述荧光素酶基因的核苷酸序列是序列1的727
‑
2379位，所述调控序列(LTR)的核苷酸序列是序列1的第40
‑
665位。
[0010]本专利技术提供了构建上述重组细胞的方法，包括将上述重组载体导入到哺乳动物细胞得到重组细胞。
[0011]所述重组细胞具有荧光素酶活性。
[0012]本专利技术还提供了一种重组载体，含有荧光素酶基因表达盒，所述荧光素酶基因表达盒是包含荧光素酶基因及所述荧光素酶基因表达所需的调控序列的双链DNA分子，所述荧光素酶基因的核苷酸序列是序列1的第727
‑
2379位，所述调控序列(LTR)的核苷酸序列是序列1的第40
‑
665位。
[0013]上述重组载体中，所述荧光素酶基因表达盒的核苷酸序列是序列1的第40
‑
2379位。
[0014]所述重组载体的核苷酸序列是序列1。
[0015]本专利技术所述的重组细胞中，所述哺乳动物细胞为人胚肾细胞系。
[0016]所述的重组细胞中，所述人胚肾细胞系为HEK293T细胞。
[0017]本专利技术还提供了上述重组载体、重组细胞或构建重组细胞的方法在下述任一种中的应用：
[0018]1)制备识别或辅助识别HIV
‑
1LTR的产品；
[0019]2)制备激活HIV病毒转录的产品；
[0020]3)制备筛选艾滋病药物的产品。
[0021]所述HIV病毒或HIV
‑
1可为HIV
‑
1CRF55_01B亚型(Human Immunodeficiency Virus TypeⅠsubtype CRF55_01B)。
[0022]所述艾滋病可为由HIV
‑
1CRF55_01B亚型(Human Immunodeficiency Virus TypeⅠsubtype CRF55_01B)临床分离株CRF55_01B引起的疾病。
[0023]采用激活并杀死(shock and kill)治疗研究策略，即先激活潜伏免疫细胞内的休眠病毒再消除，通过转录激活潜伏的病毒，使艾滋病毒得以表达和复制，从而清除病毒。这种方法依赖于转录沉默的HIV
‑
1启动子的抑制或激活。
[0024]通过成功构建了CRF55_01B亚型临床分离株CRF55_01B LTR区的荧光报告系统，可广泛应用于治疗艾滋病药物的筛选，对艾滋病的防治研究具有重要的应用价值和意义。
附图说明
[0025]图1为验证荧光报告载体pGL4.17
‑
HIV
‑
1CRF55_01B_LTR的CRF55_01B_LTR片段插入情况。
[0026]图2为PCR验证HEK293T细胞基因组中CRF55_01B LTR片段是否整合成功。
[0027]图3为转染后的HEK293T细胞系荧光素酶活性。
具体实施方式
[0028]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0029]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.含有重组载体的重组细胞，其特征在于，所述重组载体为含有荧光素酶基因表达盒，所述荧光素酶基因表达盒是包含荧光素酶基因及所述荧光素酶基因表达所需的调控序列的双链DNA分子，所述荧光素酶基因的核苷酸序列是序列1的第707
‑
2359位，所述调控序列(LTR)的核苷酸序列是序列1的第40
‑
665位。2.构建权利要求1所述的重组细胞的方法，包括将权利要求1中所述的重组载体导入到哺乳动物细胞得到重组细胞。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为人胚肾细胞系。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人胚肾细胞系为HEK293T细胞。5.如权利要求2
‑
4中任一所述的方法，其特征在于，所述重组细胞具有荧光素酶活性。6.重组载体，其特征在于，所述重组载体含有荧光素酶基因表达盒，所述荧光素酶基因表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，贾磊，郭星，刘梦莹，李韩平，刘永健，韩婧婉，张伯寒，王晓林，李天一，李敬云，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：