重组脂肪干细胞、制备方法、应用及促进创面愈合的药物技术

本发明专利技术涉及一种重组脂肪干细胞、制备方法、应用及促进创面愈合的药物，属于基因工程技术领域。为解决现有干细胞治疗糖尿病创面愈合见效慢、效果不理想的问题，本发明专利技术提供了一种重组脂肪干细胞、制备方法、应用及促进创面愈合的药物。本发明专利技术通过构建过表达GDF11基因的慢病毒载体，转染人脂肪干细胞制备的重组脂肪干细胞具有能够安全、持久的表达抗衰老基因GDF11的优势，协同人脂肪干细胞共同发挥作用，对于促进糖尿病创面的愈合具有较好的应用前景。本发明专利技术从体内体外证实了过表达GDF11基因的重组脂肪干细胞能够促进糖尿病创面愈合，对于糖尿病裸鼠背部创面具有良好的治疗效果。于糖尿病裸鼠背部创面具有良好的治疗效果。于糖尿病裸鼠背部创面具有良好的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
重组脂肪干细胞、制备方法、应用及促进创面愈合的药物


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及重组脂肪干细胞、制备方法、应用及促进创面愈合的药物。

技术介绍

[0002]创面愈合是一个复杂的生物学过程，是炎性细胞、修复细胞、细胞外基质及细胞因子等多因素共同参与并高度协调、相互调控的复杂过程。糖尿病患者皮肤易受损伤，损伤后往往反复发作，迁延不愈，形成顽固难愈性溃疡，这主要是因为糖尿病患者机体的组织细胞长时间处于高糖环境，使局部皮肤组织细胞、蛋白质等被糖基化，引起血管内皮功能异常，反应受损；巨噬细胞的功能异常，炎症反应延长失衡；生长因子缺乏或者受损，明胶组织的减少、表皮屏障功能的失调，以及肉芽组织的减少等，导致溃疡难以修复。因此，糖尿病难愈性溃疡的治疗是临床急需解决的重要课题之一。
[0003]目前治疗糖尿病溃疡的方法有传统外科清创、高压氧治疗、植皮治疗法、生长因子治疗等。近年来，随着组织工程学研究的不断深入，采用干细胞治疗糖尿病溃疡取得了一定的效果，但是这种方法见效较慢，后期愈合效果仍不理想。

技术实现思路

[0004]为解决现有干细胞治疗糖尿病创面愈合见效慢、效果不理想的问题，本专利技术提供了重组脂肪干细胞、制备方法、应用及促进创面愈合的药物。
[0005]本专利技术的技术方案：一种重组脂肪干细胞，所述重组脂肪干细胞是通过将GDF11基因转染到脂肪干细胞中获得。
[0006]进一步的，所述脂肪干细胞来源于人体脂肪组织。
[0007]进一步的，GDF11基因的载体为慢病毒载体，所述慢病毒载体为pCDH
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CMV
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GDF11
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EF1
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GFP
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Puro。
[0008]一种重组脂肪干细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤一、提取人脂肪干细胞；步骤二、构建过表达GDF11基因的慢病毒载体；步骤三、用步骤二构建的过表达GDF11基因的慢病毒载体转染人脂肪干细胞，获得稳定过表达GDF11基因的重组脂肪干细胞。
[0009]进一步的，步骤一所述提取人脂肪干细胞的方法为胶原酶消化法。
[0010]进一步的，步骤二所述过表达GDF11基因的慢病毒载体为：pCDH
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CMV
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GDF11
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EF1
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GFP
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Puro。
[0011]进一步的，步骤二所述过表达GDF11基因的慢病毒载体感染的感染复数值为160~180。
[0012]一种重组脂肪干细胞在制备促进创面愈合的药物中的应用。
[0013]进一步的，所述创面为糖尿病创面。
[0014]一种促进创面愈合的药物，含有有效剂量的本专利技术提供的重组脂肪干细胞。
[0015]本专利技术的有益效果：本专利技术通过构建过表达GDF11基因的慢病毒载体，转染人脂肪干细胞后高表达抗衰老基因GDF11，与干细胞共同发挥作用，创造有利于皮肤再生的微环境。本专利技术制备的过表达GDF11基因的重组脂肪干细胞具有能够安全、持久的表达抗衰老基因GDF11的优势，协同人脂肪干细胞共同发挥作用，对于促进糖尿病创面的愈合具有较好的应用前景。本专利技术从体内体外证实过表达GDF11基因的重组脂肪干细胞能够促进糖尿病创面愈合，过表达GDF11基因的重组脂肪干细胞，对于糖尿病裸鼠背部创面具有良好的治疗效果，同时新生组织中的胶原组织含量也得到提高，创面愈合的速度更快，愈合效果更好。本专利技术首创GDF11修饰脂肪干细胞治疗糖尿病创面方法为临床应用提供参考。
附图说明
[0016]图1为过表达GDF11基因的慢病毒载体示意图；图2为倒置显微镜下人脂肪干细胞的形态照片；图3为倒置荧光显微镜下观察慢病毒转染后人脂肪干细胞GFP荧光照片；图4为GDF11组和对照组CCK8细胞增殖情况对比图；图5为GDF11组和对照组裸鼠糖尿病创面施药7天后的愈合情况对比图；图6为GDF11组和对照组裸鼠糖尿病创面愈合第7天创面中I型胶原的免疫组化染色对比照片；图7为GDF11组和对照组裸鼠糖尿病创面愈合第7天创面中I型胶原蛋白相对表达量的对比图。
实施方式
[0017]下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本专利技术实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本专利技术实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
[0018]本实施例提供了一种重组脂肪干细胞及其制备方法。
[0019]一种重组脂肪干细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤一、提取人脂肪干细胞：本实施例中人脂肪组织来源于临床中抽脂患者，提取人脂肪干细胞采用胶原酶消化法。
[0020]取抽脂术后的脂肪组织，首先用含1%双抗（青霉素
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链霉素）PBS冲洗3
‑
5次，尽量将其中的血管及残留物质洗净。随后将组织剪碎充分乳化后，将组织移入离心管中，加入等体积I型胶原酶，放入37℃水浴摇床中，消化30
‑
50min。消化结束后，加入等体积完全培养液（89% F
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12 DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗）终止消化。1800g，10min离心。离心后，弃去
mmol/L表示造模成功。在其背部切开一个1cm*1cm全层皮肤创口。
[0029]随机将裸鼠分为（1）对照组：未携带目的基因的空病毒转染的人脂肪干细胞组；（2）GDF11组：实施例1制备的过表达GDF11的重组脂肪干细胞，每组5只小鼠。
[0030]人脂肪干细胞创面移植：各组分别注射脂肪干细胞 (浓度为5
×
105个/ml)，裸鼠背部分别取4个注射点进行皮下注射。动物在相同条件下进行饲养，每天观察创面的愈合情况和动物状态，包括创面面积变化情况、局部炎症、肉芽组织增生，并用软尺固定裸鼠创面边缘部位，用高倍相机拍摄创面组织，观察和分析创面愈合情况。图5为第7天GDF11组和对照组裸鼠糖尿病创面施药7天后的愈合情况对比图，可以观察到GDF11组创面愈合率更高。
[0031]（2）在第7天，利用二氧化碳对各组裸鼠实施安乐死，用外科手术刀和眼科剪剪下裸鼠背部皮肤创面组织，标记后将糖尿病裸鼠模型的创面皮肤组织样本用4%的多聚甲醛固定用于后续实验。组织免疫组化分析，将包埋好的蜡块切片后在热水中加热，然后粘贴在载玻片上，在45℃烘干箱中干燥。烘干箱取出后加入二甲苯清除样本上的石蜡，然后载玻片被放置在梯度乙醇中，每个试剂中放置2分钟，进行抗原修复，最后入蒸馏水。置于3% H2O2溶液中约10分钟后用清水洗涤2次，再置于柠檬酸缓冲液中，用微波炉进行加热。用清水洗涤并加入PBS缓冲液，再用烘干机烘干，之后立即加入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组脂肪干细胞，其特征在于，所述重组脂肪干细胞是通过将GDF11基因转染到脂肪干细胞中获得。2.根据权利要求1所述一种重组脂肪干细胞，其特征在于，所述脂肪干细胞来源于人体脂肪组织。3.根据权利要求1或2所述一种重组脂肪干细胞，其特征在于，GDF11基因的载体为慢病毒载体，所述慢病毒载体为pCDH
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CMV
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GDF11
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EF1
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GFP
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Puro。4.一种重组脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、提取人脂肪干细胞；步骤二、构建过表达GDF11基因的慢病毒载体；步骤三、用步骤二构建的过表达GDF11基因的慢病毒载体转染人脂肪干细胞，获得稳定过表达GDF11基因的重组脂肪干细胞。5.根据权利要求4所述一种重组脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，步骤一所述提取人脂肪...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵月，肖志波，张淼波，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：