一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株及其构建方法和应用，属于病毒基因工程技术领域。本发明专利技术提供了表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，以弹状病毒科病毒为骨架含有两个拉沙热病毒的GP基因，并且定向敲除了狂犬病病毒基因组中原有的GP基因。本发明专利技术以构建的重组狂犬病病毒制备疫苗，不仅具有良好的安全性，具有良好的免疫原性，对拉沙热的预防和治疗具有重要意义。对拉沙热的预防和治疗具有重要意义。对拉沙热的预防和治疗具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于病毒
，具体涉及一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]拉沙热(Lassa Fever,LF)是由拉沙热病毒(Lassa fever virus,LASV)引起的一种病毒性出血热。拉沙热病毒的天然宿主是多乳鼠，多分布在西非地区，其活动不受国界限制。人类可通过直接或间接接触带毒动物或其分泌物而发生感染，同时病毒也可在人与人之间传播，每年造成大量感染和死亡病例
[1]。LF自1969年在尼日利亚被首次发现以来，每年均有暴发且暴发频率呈逐年递增趋势。LASV感染者的高死亡率和多国出现输入性病例引起国际社会的高度重视，LASV再次成为医学界研究的热点。
[0003]由于该病的高死亡率、易于在人与人之间接触传播的能力以及气溶胶传播的潜力，LASV被列为生物安全四级(Biosafety level 4,BSL
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4)病原微生物，且被美国国家过敏和传染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases,NIAID)列为生物防御A类制剂。非人灵长动物(Non
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human primates,NHPs)模型的高昂成本和研究所需的BSL
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4实验室等因素，阻碍了疫苗的研发进程。目前尚无获批可用于LF的治疗性药物和预防用疫苗，唯一可用的药物是早期通过静脉注射途径注射抗病毒药物利巴韦林。鉴于以上因素，LF已被WHO和流行病预防创新联盟(Coalition for Epidemic Preparedness Innovations,CEPI)列为对全球健康构成重大威胁的疾病之一，应重点关注该病毒的传播机制、疫苗研发和治疗药物筛选。
[0004]目前，我国对LF的研究相对较少，缺乏LF预防性疫苗和治疗性药物，因此，积极开展有效的预防控制研究工作，尤其是研发安全有效的LF疫苗，是防止外来疫病输入我国，维护我国生物安全的重要举措。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株及其构建方法和应用，使制备的重组病毒不仅具有良好的安全性，作为拉沙热疫苗候选株具有良好的免疫原性，为拉沙热病毒的治疗和免疫防控提供新手段。
[0006]本专利技术提供了一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，在弹状病毒科病毒的基础上，用两个拉沙热病毒GP基因插入到弹状病毒科病毒全长基因组中。
[0007]优选的，所述拉沙热病毒GP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]优选的，两个拉沙热病毒GP基因中的一个插在P基因和M基因之间，另外一个插在M基因和L基因之间。
[0009]优选的，所述弹状病毒科病毒包括狂犬病病毒和水泡性口炎病毒。
[0010]优选的，所述狂犬病病毒的毒株为SRV9毒株。
[0011]本专利技术提供了一种所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株的构建方法，包括以下步骤：
[0012]1)分别将两个拉沙热病毒GP基因克隆至含有SRV9全长基因组的重组全长质粒中，并替换SRV9 GP基因，得到表达LASV GP的重组全长质粒；
[0013]2)将步骤1)中所述表达SRV9
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LASV GP的重组全长质粒与辅助质粒共转染细胞进行病毒拯救，得到重组病毒rSRV9
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2LASV
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GP。
[0014]优选的，步骤1)中扩增所述两个拉沙热病毒GP基因的引物包括LASV/GP
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F1/LASV/GP
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R1引物对和LASV/GP
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F2/LASV/GP
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R2引物对；
[0015]所述LASV/GP
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F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0016]所述LASV/GP
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R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0017]所述LASV/GP
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F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0018]所述LASV/GP
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R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0019]优选的，步骤1)中所述辅助质粒包括表达狂犬病病毒的核蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒、表达狂犬病病毒的糖蛋白的辅助质粒；
[0020]所述表达LASV GP的重组全长质粒、表达狂犬病病毒的核蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒和表达狂犬病病毒的糖蛋白的辅助质粒的质量比为2～3:0.1～0.2:0.6～0.7:0.25～0.3:3～4。
[0021]优选的，所述细胞包括Vero E6细胞。
[0022]本专利技术提供了所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株或所述构建方法得到的重组病毒株在制备预防和/或治疗拉沙热的疫苗中的应用。
[0023]本专利技术提供的表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，在弹状病毒科病毒的基础上，用两个拉沙热病毒GP基因替换弹状病毒科病毒中GP基因。本专利技术通过将拉沙热病毒GP蛋白的全部编码基因整合至弹状病毒科病毒的基因组序列中，在弹状病毒科病毒中高效表达拉沙热病毒的GP蛋白，得到的重组狂犬病病毒不仅具有良好的安全性，作为拉沙热疫苗具有良好的免疫原性，这在拉沙热病毒的治疗和免疫领域，具有重要意义。
附图说明
[0024]图1为本专利技术实施例中重组狂犬病病毒感染性克隆的构建示意图；
[0025]图2为拉沙热病毒GP基因的PCR电泳结果和酶切结果，其中A为LASV GP基因的PCR结果；B为LASV GP经Pst I/Kpn I双酶切(泳道2)及BsiW I/Pme I双酶切(泳道3)结果；
[0026]图3为本专利技术构建的重组全长质粒的酶切鉴定结果，其中泳道1为Marker，泳道2为重组全长质粒pSRV9
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2LASV
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GP BsiWI/Pme I双酶切鉴定(见泳道)，泳道3为Pst I/Kpn I双酶切鉴定；
[0027]图4为利用直接免疫荧光抗体鉴定重组病毒rSRV9
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2LASV
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GP结果图；
[0028]图5为重组病毒的间接免疫荧光鉴定重组病毒rSRV9
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2LASV
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GP结果图，其中A为LASV/Josiah GP鼠单克隆抗体鉴定重组病毒rSRV9
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2LASV
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GP表面糖蛋白结果，B为RABV/SRV9 GP鼠单克隆抗体鉴定重组病毒rSRV9
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2LASV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，其特征在于，在弹状病毒科病毒的基础上，用两个拉沙热病毒GP基因替代弹状病毒科病毒中GP基因。2.根据权利要求1所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，其特征在于，所述拉沙热病毒GP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，其特征在于，两个拉沙热病毒GP基因中的一个插在P基因和M基因之间，另外一个插在M基因和L基因之间。4.根据权利要求1～3任意一项所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，其特征在于，所述弹状病毒科病毒包括狂犬病病毒和水泡性口炎病毒。5.根据权利要求4所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，其特征在于，所述狂犬病病毒的毒株为SRV9毒株。6.一种权利要求1～5任意一项所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分别将两个拉沙热病毒GP基因克隆至含有SRV9全长基因组的重组全长质粒中，并替换SRV9 GP基因，得到表达LASV GP的重组全长质粒；2)将步骤1)中所述表达LASV GP的重组全长质粒与辅助质粒共转染细胞进行病毒拯救，得到重组病毒rSRV9
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2LASV
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GP。7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，步骤1)中扩增所述两个拉沙热病毒GP基因的引物包括LASV/GP
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F1/LA...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫飞虎，赵永坤，冯娜，王铁成，毕津豪，李恩涛，杨松涛，夏咸柱，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：