过表达MtWUSCHEL基因在提高豆科牧草叶面积和延迟开花中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种过表达蒺藜苜蓿MtWUSCHEL基因在增加豆科牧草叶片面积和延迟开花中的应用；其中所述蒺藜苜蓿MtWUSCHEL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术在紫花苜蓿背景下利用基因MtWUSCHEL构建植物过表达载体，进行遗传转化操作，获得过表达转基因植物。分析表明过表达植株的牧草品质得到显著改善，使紫花苜蓿的开花时间延迟高达20天，而且可以使叶片面积提高约11％。预示本发明专利技术所述应用有望在培育新型豆科牧草植物品种中发挥重要的作用，对促进我国草业经济作物的生产具有重大意义。具有重大意义。具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
过表达MtWUSCHEL基因在提高豆科牧草叶面积和延迟开花中的应用


[0001]本专利技术涉及一种茎尖干细胞决定相关的转录因子WUSCHEL(WUS)基因的应用，尤其涉及一种过表达蒺藜苜蓿MtWUSCHEL(简称MtWUS)基因在增加豆科牧草(如紫花苜蓿)叶片面积和延迟开花中的应用。属于生物基因工程


技术介绍

[0002]紫花苜蓿素有“牧草之王”的美称，是世界上利用最早、栽培最广的一种优良的豆科牧草，是畜牧业生产中重要的蛋白饲料来源之一，因兼具抗逆性强、产量高、适口性佳等优点，具有极大的生产利用潜力和研究价值。但我国的紫花苜蓿存在产量较低、品质较差等问题，远远不能满足畜牧业和草业发展的多方面的需求，因此迫切需要提高苜蓿的产量和质量水平，以满足市场的需要。
[0003]苜蓿的蛋白质主要存在于叶片中，而且叶片最多可贡献产草量的60％，因此叶片不仅是苜蓿生长发育、产量构成和品种特性的重要指标，更是反映苜蓿牧草营养价值的重要指标之一。一般而言，叶片面积越大，蛋白质含量越丰富，苜蓿的营养价值就越高，利用价值也就相对越高。因而叶量丰富、蛋白含量高、品质优质的苜蓿新品种的选育一直是苜蓿育种工作者追求的目标。
[0004]开花是苜蓿从营养生长到生殖生长转变的关键，在花期时牧草质量下降是牧草作物普遍存在的问题，这对苜蓿牧草产量的影响很大。设法延迟苜蓿开花，有望在以下几个方面得到改善：一是其营养生长阶段被延长，生物量的积累增加，且更长时间地保持牧草的高品质；二是通过延迟开花，还可以保护植株免受冬末和早春霜冻的影响；三是可以通过延长苜蓿的收获时间来方便田间管理。然而目前苜蓿开花时间和生物量调控的遗传和基因组基础仍不清楚，这主要是由于该物种的同源多倍体特性和缺乏足够的基因组资源。
[0005]WUS是WOX(WUSCHEL
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RELATED HOMEOBOX)基因家族的成员，在植物发育的关键时期起到重要的调控作用，包括干细胞生态位的维持和茎顶端分生组织(SAM)的发育等(Clark,2001；Fletcher,2002；Kieffer et al.,2006；Laux et al.,1996)。水稻中OsWUS的功能缺失，导致分蘖数降低(Xia et al.,Plant Journal,2020,104,1635
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1647)。在玉米中，ZmWUS1和ZmWUS2在腋生分生组织(AM)中高表达，参与了分枝调控等(Nardmann and Werr,2006)。在蒺藜苜蓿中，有报道WUS的同源基因HDL(HEADLESS)作为一个转录抑制因子发挥功能。HDL的功能缺失突变体表现为腋生分生组织发育受阻并丧失顶端优势、叶片呈心形等(Ikeda et al.,2009；Meng et al.,2019)。但关于过表达蒺藜苜蓿MtWUSCHEL基因在增加豆科牧草(如紫花苜蓿)叶片面积和延迟开花中的应用还未见报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种过表达蒺藜苜蓿MtWUSCHEL(MtWUS)基因在增加豆科牧草叶片面积和延迟开花中的应用。
[0007]本专利技术所述过表达蒺藜苜蓿MtWUSCHEL(MtWUS)基因在增加豆科牧草叶片面积和延迟开花中的应用；其中所述蒺藜苜蓿MtWUSCHEL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述应用是通过RT
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PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆MtWUSCHEL基因编码序列，构建植物过表达载体，进行植物转基因操作导入豆科牧草植物细胞，获得过表达MtWUSCHEL基因的豆科牧草转基因株系实现。
[0008]上述的应用中：所述豆科牧草优选是紫花苜蓿或蒺藜苜蓿。
[0009]上述的应用中：所述植物过表达载体优选是pEarleyGate103
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MtWUS。
[0010]本专利技术所述过表达蒺藜苜蓿MtWUSCHEL基因在提高紫花苜蓿的牧草品质中的应用；其中所述蒺藜苜蓿MtWUSCHEL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]申请人利用引物MtWUS
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F(CACCATGGAACAGCCTCAACAACAACAAC)和MtWUS
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R(TTAATTAGCATAATCTGGTGACCTACAGC)，通过RT
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PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆MtWUS基因编码序列，构建植物过表达载体pEarleyGate103
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MtWUS，进行植物转基因操作导入紫花苜蓿植物细胞，获得过表达MtWUS基因的紫花苜蓿转基因株系。检测表明，过表达MtWUS植株的叶片面积增大，牧草品质显著提高，同时开花时间显著延迟(约20天)，这一数据远高于目前现有的苜蓿品种。
[0012]本专利技术的有益效果是：首次应用所述蒺藜苜蓿MtWUSCHEL基因在复叶物种苜蓿中过表达显著提高了转基因植株的叶片面积并延迟了开花时间(见图1和图2)，结果显示可以使紫花苜蓿的开花时间延迟高达20天，并且可以使叶片面积提高约11％。预示本专利技术所述应用有望在培育新型豆科牧草植物品种中发挥重要的作用，此也为作物改良性提供了新的理论依据和实践基础，对促进我国草业经济作物的生产具有重大意义。
附图说明
[0013]图1.过表达MtWUS基因的转基因紫花苜蓿株系的开花时间分析。
[0014]其中，A是WT和MtWUS过表达植株整株表型，B是WT植株顶端开花表型，C
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E是MtWUS过表达植株不同株系顶端未开花表型，F是WT和MtWUS过表达植株第一朵花出现的节间位置数统计，G是WT和MtWUS过表达植株第一朵花出现的天数统计；WT为野生型，OE
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1、OE
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3和OE
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5为MtWUS过表达植株不同株系。
[0015]结果显示紫花苜蓿的野生型植株在40天左右开花，过表达MtWUS基因的转基因紫花苜蓿植株在60天左右开花，这说明MtWUS基因过表达之后明显延迟了紫花苜蓿的开花时间。
[0016]图2.过表达MtWUS基因的转基因紫花苜蓿株系的叶片表型及相关指标分析。
[0017]其中，A是WT和MtWUS过表达植株叶片表型，B是WT和MtWUS过表达植株叶面积统计，C是WT和MtWUS过表达植株叶片长宽比统计，D是WT和MtWUS过表达植株叶片粗蛋白含量测定，E是WT和MtWUS过表达植株鲜重统计，F是WT和MtWUS过表达植株叶片总叶绿素、叶绿素a及叶绿素b含量统计；WT为野生型，OE
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1、OE
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3和OE
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5为MtWUS过表达植株不同株系。
[0018]结果显示：与野生型相比，过表达MtWUS基因的转基因紫花苜蓿植株的叶片变大并且叶片颜色更加绿。为此选取生长状态一致的野生型和MtWUS过表达植株，分别统计本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.过表达蒺藜苜蓿MtWUSCHEL基因在增加豆科牧草叶片面积和延迟开花中的应用；其中所述蒺藜苜蓿MtWUSCHEL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述应用是通过RT
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PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆MtWUSCHEL基因编码序列，构建植物过表达载体，进行植物转基因操作导入豆科牧草植物细胞，获得过表达MtWUSCHE...

【专利技术属性】
技术研发人员：周传恩，王洪峰，韩璐，王燕，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：