一种基于结构的抗病蛋白改良的方法及获得的突变蛋白质技术

本发明专利技术公开了一种基于结构的抗病蛋白改良的方法及获得的突变蛋白质。本发明专利技术所要保护的一个技术方案是提高植物中R蛋白对病毒抗性的方法。所述方法包括使用定点突变的方法将所述R蛋白的CC结构域疏水区域中的氨基酸的编码核苷酸进行突变得到R突变体蛋白的步骤，所述R突变体蛋白对病毒的抗性反应高于所述R蛋白对病毒的抗性反应。实验证明，通过对辣椒Tsw蛋白的N端CC结构域的疏水槽区段即序列表中序列1的第137位氨基酸进行点突变可达到稳定加强R蛋白抗性功能的目的，本发明专利技术所提供的方法可应用于提高植物的抗病性，在实际生产中，可应用于植物抗病育种。于植物抗病育种。

【技术实现步骤摘要】
一种基于结构的抗病蛋白改良的方法及获得的突变蛋白质


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于结构的抗病蛋白改良的方法及获得的突变蛋白质。

技术介绍

[0002]有害生物(包括昆虫、线虫、病原微生物、寄生性植物等等)侵染造成作物严重减产和品质的下降。在长期的与有害生物斗争过程中，植物成功的适应并进化出不同层次的免疫抗性机制来抵御不同的威胁，包括抗性(R，resistance gene)基因介导的抗性，RNA沉默策略，植物激素参与调控的抗性机制等等。随着全球气候变暖，国际贸易交流不断增加等原因，新的病原不断出现，已有的植物抗性机制被有害生物突破导致严重病虫害现象时有发生，另外杀虫剂、杀菌剂等抗药性问题不断涌现，这些都严重影响了粮食安全、食品安全和生态安全。发掘新的抗性基因、研究和利用植物免疫基因作用机制就显得尤为重要。与此同时，已有植物抗性基因的改良和应用也是一种获得持久抗性的高效策略。
[0003]在过去的几十年研究中，对于植物R基因介导的抗性机制已有了长足发展，基础理论框架体系已经较为明确，大多数的胞内免疫受体蛋白(Nucleotide
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binding leucine
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rich repeat receptor,NLR)由R基因编码，他们通过编码抗性蛋白参与识别病原效应因子，进而引发细胞坏死等超敏反应，将有害生物限制在侵染位点，从而获得有效抗性。已有研究发现通过对参与病原效应子识别的结构域的修饰可以扩大R蛋白识别的病原微生物种类，从而增加其抗病谱。目前尚无根据其结构特征设计提高抗病蛋白活性的研究。关于R蛋白，根据NLR的N端结构域，这类受体蛋白可以被分为两大类，即N末端含有Toll
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白细胞介素1受体(Toll/IL
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1receptor,TIR)结构域的TIR
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NBS
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LRR受体和N末端含有卷曲螺旋(Coiled
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coil，CC)结构域的CC
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NBS
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LRR受体两大类型。研究表明部分R蛋白的N末端单独表达时可以引发细胞坏死反应，但是对这种现象的机制解析还很少。近期植物中第一个抗病小体，CC
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NBS
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LRR受体ZAR1蛋白的激活过程被解析，ZAR1的CC区段可以在激活之后形成孔状结构，被认为具有离子通道的活性。另外后续TIR
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NBS
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LRR类蛋白RPP1的结构解析也证明，激活后的RPP1蛋白可以通过形成一个四聚体来发挥NAD
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水解酶的功能。另有一些研究也表明这一过程与蛋白的质膜定位有关。
[0004]番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)是布尼亚病毒中的一类侵染植物的病毒，大部分都是由昆虫介体传播。番茄斑萎病毒的寄主极其广泛，可以侵染超过50个属的800多种植物，包括像茄科，菊科等，造成多种作物严重的病害损失。目前为止，抗番茄斑萎病毒的自然的遗传资源很少，至今只鉴定了两个番茄斑萎病毒相关的抗性蛋白，分别是番茄中的Sw
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5b和辣椒中的Tsw。其中Sw
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5b蛋白特异性识别番茄斑萎病毒的移动蛋白(NSm)来发挥作用；而Tsw识别非结构蛋白(NSs)，Tsw是一个近些年在辣椒中克隆的抗性基因，它编码的Tsw蛋白特异性的识别番茄斑萎病毒中的NSs蛋白，并引发植物的超敏反应激发抗性。这两个R蛋白的缺点是抗性谱较窄，而且近年来，抗性突破毒株不断涌现，另外Tsw介导的抗性较易受温度等外界生物或非生物环境因子影响。比如常见的多种病毒
共感染或者高温等，都会导致抗性全部丧失。
[0005]对已有抗性基因进行定向改良是提高作物抗性和产量行之有效的方法。由R基因编码的胞内免疫受体蛋白NLR参与了植物对于病原体分子的感知和防御激活等过程，这对于植物的免疫进而是生存都至关重要。尽管有很多工作对于NLR蛋白的结构特征作出了解析，但是尚未涉及基于结构的对于NLR介导的抗性进行优化改良等方面。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是如何通过R蛋白结构设计提高植物抗病性。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了提高植物中R蛋白对病毒抗性的方法。所述R蛋白可包含CC结构域。所述CC结构域从N端开始的第135
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137位氨基酸可形成疏水区域。所述方法可包括使用定点突变的方法将所述R蛋白的CC结构域疏水区域中的氨基酸的编码核苷酸进行突变得到R突变体蛋白的步骤。所述R突变体蛋白对病毒的抗性反应高于所述R蛋白对病毒的抗性反应。
[0008]上文所述定点突变可为将所述R蛋白的CC结构域疏水区域中的酪氨酸的编码核苷酸突变为色氨酸的编码核苷酸，导致所述CC结构域从N端开始的第135
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137位氨基酸中的酪氨酸突变为色氨酸。
[0009]上文所述定点突变的方法具体可为使用带有突变核苷酸的引物扩增目的片段，得到特定核苷酸位点核苷酸发生改变的定点突变后的目的片段。
[0010]上文所述植物可为下述任一种：
[0011]A1)单子叶植物；
[0012]B1)双子叶植物，
[0013]B2)管状花目，
[0014]B3)茄科，
[0015]B4)烟草属，
[0016]B5)烟草；
[0017]B6)辣椒属，
[0018]B7)辣椒；
[0019]B8)番茄属，
[0020]B9)番茄。
[0021]上文所述方法中，所述R蛋白可为辣椒Tsw蛋白。所述定点突变可为将序列表中序列2的第409
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411位的TAT(酪氨酸的密码子)替换为TGG(色氨酸的密码子)，保持序列2的其它核苷酸不变，导致序列表中序列1的137位的酪氨酸残基替换为色氨酸残基。
[0022]上文所述方法中，所述R蛋白可为番茄SlCNL
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1蛋白。所述定点突变可为将序列表中序列4所示的第403
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405位的TAT(酪氨酸的密码子)替换为TGG(色氨酸的密码子)，保持序列4其它核苷酸不变，导致序列表中序列3的135位的酪氨酸残基替换为色氨酸残基。
[0023]上文所述病毒可为番茄斑萎病毒。
[0024]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了突变体蛋白。所述突变体蛋白为突变体蛋白A或突变体蛋白B。
[0025]所述突变体蛋白A可为由野生型Tsw蛋白进行1个氨基酸残基的替代构成的突变体
蛋白。所述突变体蛋白A与所述野生型Tsw蛋白相比，可为在所述野生型Tsw蛋白从N端开始的第137位氨基酸残基发生替代。所述突变体蛋白A具有对病毒蛋白的抗性反应，且所述突变体蛋白A对病毒蛋白的抗性反应高于所述野生型Tsw蛋白对所述病毒的抗性反应。所述野生型Tsw蛋白可来源于辣椒。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提高植物中R蛋白对病毒抗性的方法，其特征在于：所述R蛋白包含CC结构域，所述CC结构域从N端开始的第135
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137位氨基酸形成疏水区域；所述方法包括使用定点突变的方法将所述R蛋白的CC结构域疏水区域中的氨基酸的编码核苷酸进行突变得到R突变体蛋白的步骤，所述R突变体蛋白对病毒的抗性反应高于所述R蛋白对病毒的抗性反应。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述定点突变为将所述R蛋白的CC结构域疏水区域中的酪氨酸的编码核苷酸突变为色氨酸的编码核苷酸，导致所述CC结构域从N端开始的第135
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137位氨基酸中的酪氨酸突变为色氨酸。3.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于：所述植物为下述任一种：A1)单子叶植物；B1)双子叶植物，B2)管状花目，B3)茄科，B4)烟草属，B5)烟草；B6)辣椒属，B7)辣椒；B8)番茄属，B9)番茄。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述R蛋白为辣椒Tsw蛋白，所述定点突变为将序列表中序列2的第409
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411位的TAT(酪氨酸的密码子)替换为TGG(色氨酸的密码子)，保持序列2的其它核苷酸不变，导致序列表中序列1的137位的酪氨酸残基替换为色氨酸残基。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述R蛋白为番茄SlCNL
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1蛋白或番茄SlCNL
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1蛋白CC结构域，所述定点突变为将序列表中序列4所示的第403
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405位的TAT(酪氨酸的密码子)替换为TGG(色氨酸的密码子)，保持序列4其它核苷酸不变，导致序列表中序列3的135位的酪氨酸残基替换为色氨酸残基。6.根据权利要求1
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5中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述病毒为番茄斑萎病毒。7.突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白为突变体蛋白A或突变体蛋白B；所述突变体蛋白A是由野生型Tsw蛋白进行1个氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白，所述突变体蛋白A与所述野生型Tsw蛋白相比，在所述野生型Tsw蛋白从N端开始的第137位氨基酸残基发生替...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶健，吴秀娟，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：