一种可双端共轭不同化合物的核酸及其合成方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种可双端共轭不同化合物的核酸及其合成方法和应用。所述方法包括：采用固相合成法从3

【技术实现步骤摘要】
一种可双端共轭不同化合物的核酸及其合成方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及一种可双端共轭不同化合物的核酸及其合成方法和应用。

技术介绍

[0002]单链DNA与RNA是由一定数量的脱氧核苷酸或者核苷酸组合而成。对DNA或者RNA的结构进行一些改造，可形成如DNA修饰探针以及RNA修饰探针等核酸工具，DNA修饰探针与RNA修饰探针广泛应用在分子诊断QPCR(实时荧光定量)、STR(短串联重复序列)、以及FISH(荧光原位杂交技术)等领域。
[0003]一般地，有两种常见的方法可用于单链DNA与RNA的改造。一种为液相氨基活化酯加成法，另一种为固相亚磷酰胺三酯法。传统的液相氨基活化酯加成法是把含有氨基活性基团的DNA或RNA溶解在碱性的缓冲液中，然后加入3倍摩尔量的有机溶剂溶解的修饰染料活化酯，在常温反应4～12小时，然后加入酒精进行沉淀，同时用酒精对沉淀物进行反复洗涤，得到沉淀固体，然后用水溶解，最后经高效液相色谱仪纯化得到纯的DNA修饰探针或RNA修饰探针。固相亚磷酰胺三酯法的合成过程主要有脱保护、偶联、盖帽、氧化4个步骤，每完成4个步骤就连接上一个脱氧核苷酸或核苷酸，通过重复这4个步骤，就把一个个的脱氧核苷酸或核苷酸连接起来就形成了DNA或RNA，利用固相亚磷酰胺三酯法也可以在合成DNA/RNA过程中，把修饰染料也合成到DNA或RNA的链上。
[0004]然而，在常用的改造方法中常存在核酸3
’
端和5
’
端连接特定化合物会发生冲突的问题，例如需将5
’
端氨基与活化酯进行共轭反应，而3
’
端仍需保留氨基活性时，采用常规改造方法会同时对5
’
端、3
’
端氨基进行修饰，难以满足需求。
[0005]综上所述，如何提供一种高效合成可双端共轭不同化合物的核酸的方法，是核酸合成领域亟需解决的问题之一。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种可双端共轭不同化合物的核酸及其合成方法和应用，本专利技术设计可双端共轭不同化合物的核酸的合成方法，克服了3
’
端有氨基修饰，5
’
端氨基需要与活化酯共轭反应、3
’
端和5
’
端连接特定化合物会发生冲突的问题。
[0007]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种合成可双端共轭不同化合物的核酸的方法，所述方法包括：
[0009]采用固相合成法从3
’
端到5
’
端合成核酸分子，获得3
’
端连接在固相载体上的核酸分子，将氨基连接到所述3
’
端连接在固相载体上的核酸分子的5
’
端，将连接氨基后核酸分子与活化酯混合进行共轭反应，将所述共轭反应的产物与氨解液混合进行氨解反应，得到所述可双端共轭不同化合物的核酸，所述氨解液含有叔丁胺和甲醇。
[0010]本专利技术巧妙设计可双端共轭不同化合物的核酸制备过程，实现既能保留3
’
端氨基，又将5
’
端氨基与活化酯(NHS)进行共轭反应，同时进一步设计氨解过程，实现在不破坏酰胺键的情况下，高效地将核酸分子从固相载体上分离并去除保护基团，克服了3
’
端有氨基修饰，5
’
端氨基需要与活化酯共轭反应、3
’
端和5
’
端连接特定化合物会发生冲突的问题，增加修饰基团在合成序列中的位点，提供全新的合成思路，且氨解液配方简单、成本低，推动分子生物学的应用。
[0011]可以理解，本领域通用的核酸固相合成方法均适用于本专利技术，具体地，核酸固相合成方法可包括脱保护基团、偶联、盖帽和氧化四个步骤，合成的方向是从3
’
端向5
’
端合成，微孔玻璃珠(Controlledpore glass，CPG)是合成的载体，末端带有二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团，常见A、G、C和T单体在5
’
位置上有DMT化学保护基，保护5
’
羟基(
‑
OH)，DMT在酸性的条件下不稳定，可用3％的三氯乙酸(TCA)切除，裸露活性羟基(
‑
OH)，单体与活化剂四唑(ACT)混合，使亚磷酰胺单体活化，与羟基发生缩合反应，在缩合的过程中，对水分子的含量要求很高，通常在30ppm以下，温度在25
‑
28度为佳，在合成的实验室内要求安装除湿仪器。合成柱：CPG作为寡核苷酸依附的固体载体，填合成柱根据载样量(μm/g)计算称量，实验中CPG的载量(32μm/g)，按照200nm的合成柱计算，柱内7mg的氨解CPG。盖帽：在缩合反应的过程中，有少量的羟基未发生反应，但仍有活性，用Cap A和Cap B反应，Cap A：四氢呋喃/吡啶/醋酸酐＝8:1:1(v/v/v)，Cap B：16％甲基咪唑的四氢呋喃溶液，反应物乙酰胺与残留的羟基反应，使羟基失去活性，终止与后面的单体缩合反应，避免合成的序列中有碱基缺失。氧化：使用0.05M的碘液作为氧化剂，将碱基之间的磷从3价氧化成5价的磷，形成稳定的磷酸二酯键。
[0012]优选地，所述固相载体包括微孔玻璃珠(CPG)。
[0013]可以理解，本领域通用的核酸末端氨基修饰方法均适用于本专利技术，例如可采用亚磷酰胺单体合成的方法，将氨基缩合在核酸序列的5
’
端上。
[0014]优选地，所述活化酯包括琥珀酰亚胺活化酯和/或异硫氰酸活化酯。
[0015]优选地，所述琥珀酰亚胺活化酯包括叠氮
‑
C3
‑
琥珀酰亚胺酯(N3
‑
C3
‑
NHS ester)。
[0016]优选地，所述氨解液还包括水。
[0017]优选地，所述氨解液中所述叔丁胺、甲醇和水的体积比为1:1:(1～10)，包括但不限于1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:1:5、1:1:7、1:1:8或1:1:9。
[0018]优选地，所述共轭反应包括：
[0019]将连接氨基后核酸分子与活化酯和碱性缓冲液混合进行共轭反应。
[0020]优选地，所述碱性缓冲液包括碳酸氢钠溶液。
[0021]优选地，所述共轭反应的温度为30～40℃(例如可以是31℃、32℃、33℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃)，时间为3～10h(例如可以是4h、5h、6h、7h、8h或9h)。
[0022]优选地，所述氨解反应的温度不高于60℃。
[0023]优选地，所述氨解反应的温度为50～60℃，包括但不限于51℃、52℃、53℃、55℃、56℃、57℃、58℃或59℃。
[0024]本专利技术中，控制氨解反应的温度，在有效保护核酸分子中酰胺键的情况本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成可双端共轭不同化合物的核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：采用固相合成法从3
’
端到5
’
端合成核酸分子，获得3
’
端连接在固相载体上的核酸分子，将氨基连接到所述3
’
端连接在固相载体上的核酸分子的5
’
端，将连接氨基后核酸分子与活化酯混合进行共轭反应，将所述共轭反应的产物与氨解液混合进行氨解反应，得到所述可双端共轭不同化合物的核酸；所述氨解液含有叔丁胺和甲醇。2.根据权利要求1所述的合成可双端共轭不同化合物的核酸的方法，其特征在于，所述固相载体包括微孔玻璃珠；优选地，所述活化酯包括琥珀酰亚胺活化酯和/或异硫氰酸活化酯；优选地，所述琥珀酰亚胺活化酯包括叠氮
‑
C3
‑
琥珀酰亚胺酯。3.根据权利要求1或2所述的合成可双端共轭不同化合物的核酸的方法，其特征在于，所述氨解液还包括水；优选地，所述氨解液中所述叔丁胺、甲醇和水的体积比为1:1:(1～10)。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的合成可双端共轭不同化合物的核酸的方法，其特征在于，所述共轭反应包括：将连接氨基后核酸分子与活化酯和碱性缓冲液混合进行共轭反应；优选地，所述碱性缓冲液包括碳酸氢钠溶液；优选地，所述共轭反应的温度为30～40℃，时间为3～10h。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的合成可双端共轭不同化合物的核酸的方法，其特征在于，所述氨解反应的温度不高于60℃；优选地，所述氨解反应的温度为50～60℃。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的合成可双端共轭不同化合物的核酸方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵明，朱玉文，姚雪芳，齐金才，杨平，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：