一种可逆终止子核苷酸3制造技术

本发明专利技术提供了一种可逆终止子核苷酸3

【技术实现步骤摘要】
一种可逆终止子核苷酸3
’‑
OH保护基团的引入方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种可逆终止子核苷酸3
’‑
OH保护基团的引入方法。

技术介绍

[0002]基因测序是遗传学及分子生物学一个重要的科研工具，随着测序技术的发展，测序价格大大降低及测序仪的能力越来越高，测序技术不仅仅局限于科研市场，越来越多的应用到面向大众的普通消费市场，特别是医疗市场和临床市场。其中，二代测序NGS技术迅猛发展，凭借其低成本、高通量的优势在很多领域得到了应用，在很多探索性研究中，如在新物种基因组的de novo测序(即从头测序，是不依赖于任何参考序列对某物种进行测序，通过生物信息学分析手段进行拼接、组装，从而获得该物种全基因序列图谱)、目标区域或全基因组重测序、转录组测序、宏基因组测序、表现修饰测序等领域都取得了突破性的进展。
[0003]边合成边测序技术(SBS)是世界范围内广泛使用的NGS技术，全球90％以上的测序数据都来自SBS技术。在最常用的SBS方法中，可逆终止子核苷酸(NRT)用于确定DNA模板的序列每个RT包含修饰的核苷酸，其包括∶(1)保护基团，保护基团(如甲基叠氮，乙烯基，双硫键基团等)确保通过DNA聚合酶仅将单个碱基添加到生长DNA拷贝链的3'端，(2)荧光基团，荧光基团能够由相机检测到，不同的NRT会发出独特的荧光信号，该信号可用于确定DNA序列的顺序。在最常见的SBS方法中，将模板和测序引物固定在芯片上，并将该支撑物暴露于四种DNA核苷酸类似物中，每一种类似物包含通过可裂解链附着到含氮碱基的不同荧光团，以及脱氧核糖3'
‑
OH位的3'
‑
O
‑
保护，以及DNA聚合酶。只有正确的互补碱基退火到靶，随后在引物的3
’
末端处掺入。洗掉未掺入的核苷酸，并光学成像。引入裂解试剂以裂解链并释放荧光团并去除3'
‑
O
‑
保护基团，从而使3'
‑
OH再生，然后可以重复该循环。对于四种碱基中的每一种使用不同的荧光颜色标记，使得在每个测序循环中，可以通过其荧光信号鉴定掺入的NRT的身份。
[0004]在各式各样的3
’‑
OH保护基团中，又以甲基叠氮基团和双硫键基团最具有代表性，当今占据全球测序设备和试剂耗材主要市场的Illumina公司的核心技术之一的测序试剂荧光标记可逆终止子核苷酸的3
’‑
OH保护基团就是甲基叠氮基团，尽管含甲基叠氮基团或双硫键基团的NRT被广泛使用，但其制备方法仍然需要改进。在引入3
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OH上的甲基叠氮基团时，通常是在过量的二甲基亚砜(DMSO)和醋酸酐的作用下将3
’‑
OH转化为3
’‑
O
‑
CH2‑
S
‑
CH3，分离纯化后再用POCl3将其转化为3
’‑
O
‑
CH2‑
Cl,最后和NaN3反应将叠氮(N3)基团引入，生成3
’‑
O
‑
CH2‑
N3，合成路线示例如下所示：
[0005][0006]而在引入3
’‑
OH上的二硫键基团时，也是需要先在过量的DMSO和醋酸酐的作用下将3
’‑
OH转化为3
’‑
O
‑
CH2‑
S
‑
CH3，分离纯化后再用POCl3将其转化为3
’‑
O
‑
CH2‑
Cl,最后和硫代对甲苯磺酸钾盐以及硫醇(SH
‑
R)反应将二硫键基团引入，生成3
’‑
O
‑
CH2‑
SS
‑
R。
[0007]在这些系列反应步骤中，存在一些弊端a)DMSO和醋酸酐会生成等摩尔的二甲基硫醚，有难闻的恶臭气味，低浓度的二甲基硫醚蒸气引起恶心，食欲减退，高浓度蒸气对中枢神经系统有麻痹作用，在实际生产和实验后处理过程中，会产生大量含有恶臭味二甲基硫醚的废水和废液，不能随意排放，而且会被固废液处理公司拒收，为后处理带来了一定的困难；此外二甲基硫醚挥发性强，在处理过程中，常常伴随恶臭味从实验室或通风设备溢出，引起周边公司或环保部门的不满和投诉；b)有不可控副产物3
’‑
O
‑
Ac生成，特别是在做批量生产时，副产物3
’‑
O
‑
Ac核苷的比例更高，常常有一半以上比例，而且3
’‑
O
‑
Ac核苷的化学性质与目标产物3
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O
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CH2‑
N3核苷极为相近，分离困难。

技术实现思路

[0008]为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术的目的是为了提供一种采用一锅法进行可逆终止子核苷酸3
’‑
OH保护基团的引入方法。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用了以下的技术方案：
[0010]本专利技术提供了一种可逆终止子核苷酸3
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OH保护基团的引入方法，包括如下步骤：
[0011]步骤S1、向2
’‑
脱氧核苷中加入甲醛(H2CO)和三乙烯二胺(DABCO)，反应生成中间产物1；
[0012]步骤S2、在氮气的保护下，向中间产物1中加入N,N'
‑
二甲基硫脲(DMTU)和N
‑
氯代丁二酰亚胺(NCS)，反应生成中间产物2；
[0013]步骤S3、中间产物2与含有叠氮基团的化合物或含有硫的化合物反应生成含有3
’‑
OH保护基团的可逆终止子核苷酸(NRT)。
[0014]在一些实施例中，2
’‑
脱氧核苷具有下列结构：
[0015][0016]其中，Base为碱基或碱基类似物；
[0017]R1为羟基保护基团；
[0018]R2为H、卤素、不饱和氨基脂肪链或不饱和羟基脂肪链中的至少一种。
[0019]在一些实施例中，所述碱基或碱基类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或上述任一种碱基的类似物中的至少一种。
[0020]在一些实施例中，所述碱基或碱基类似物为
[0021][0022]在一些实施例中，所述羟基保护基团为
[0023][0024]在一些实施例中，所述不饱和氨基脂肪链为
[0025][0026][0027]其中，n为1、2、3或4，R3为氨基保护基团。
[0028]在一些实施例中，所述氨基保护基团为
[0029][0030]在一些实施例中，所述不饱和羟基脂肪链为
[0031][0032]其中，n为1、2、3或4，R1为羟基保护基团。
[0033]在一些实施例中，当中间产物2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可逆终止子核苷酸3
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OH保护基团的引入方法，其特征在于，包括如下步骤：向2
’‑
脱氧核苷中加入甲醛和三乙烯二胺，反应生成中间产物1；在氮气的保护下，向中间产物1中加入N,N'
‑
二甲基硫脲和N
‑
氯代丁二酰亚胺，反应生成中间产物2；中间产物2与含有叠氮基团的化合物或含有硫的化合物反应生成含有3
’‑
OH保护基团的可逆终止子核苷酸。2.根据权利要求1所述的可逆终止子核苷酸3
’‑
OH保护基团的引入方法，其特征在于，所述2
’‑
脱氧核苷具有下列结构：其中，Base为碱基或碱基类似物；R1为羟基保护基团；R2为H、卤素、不饱和氨基脂肪链或不饱和羟基脂肪链中的至少一种。3.根据权利要求2所述的可逆终止子核苷酸3
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OH保护基团的引入方法，其特征在于，所述碱基或碱基类似物为所述碱基或碱基类似物为4.根据权利要求2所述的可逆终止子核苷酸3
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OH保护基团的引入方法，其特征在于，所述羟基保护基团为
5.根据权利要求2所述的可逆终止子核苷酸3
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OH保护基团的引入方法，其特征在于，所述不饱和氨基脂肪链为其中，n为1、2、3或4，R3为氨基保护基团。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鑫，卓少春，郭宏伟，
申请(专利权)人：重庆铭毅智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：