一种检测家禽血清炎症水平的试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及家禽炎性监测技术领域，具体涉及一种检测家禽血清炎症水平的试剂及其制备方法，所述的试剂由核糖核酸（RNA）提取缓冲液、血清炎性因子特异性引物、内参基因引物、反转录体系反应液和荧光定量体系反应液组成，核糖核酸（RNA）提取缓冲液用于提取家禽血清样品制成总核糖核酸（Total RNA)。该试剂主要针对当前传统诊断家禽免疫状态的缺点，如敏感性差(临床症状及染色法)，操作繁琐及时间长(生化试验法)，影响因素多，主观判定影响大(变态反应法)，使其能够快速诊断家禽炎症状态，从而实现家禽疾病的快速确诊、及时防控，对早期诊断家禽疾病具有指导意义和实用价值。家禽疾病具有指导意义和实用价值。家禽疾病具有指导意义和实用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测家禽血清炎症水平的试剂及其制备方法


[0001]本专利技术涉及家禽炎性监测
，具体涉及一种检测家禽血清炎症水平的试剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]家禽是世界上主要的牲畜种群，家禽生产是重要且多样化的组成部分，因为蛋和禽肉是世界上许多人口饮食的一部分，为此动物源食品的安全性是广受关注的一个热题，然而在饲养过程中，多种重因素均可影响动物机体的健康，例如：饲养的环境、饲料的水源、免疫环节等。其中细胞因子可对机体的免疫系统作出敏感反馈，及时反馈出动物的健康状态，该类物质主要由免疫细胞产生，是一种极微量的具有广谱生物学活性的小分子肽，包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素等多个家族。经科学研究表明，白细胞介素6（IL
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6）和肿瘤坏死因子α(TNF
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α)与多种疾病具有强相关性，被认为是炎性因子的标志。家禽在与外界接触的过程中，由于持续受环境刺激导致产生应激反应，如疾病发生、放射线照射等均会导致机体内炎性因子产生动态变化。若长期无法消除，则会造成病理性积累，导致家禽的机体代谢紊乱，诱发家禽出现严重疾病，如肝炎、病毒疾病、免疫失败等。因此，能够实时监控动物的健康状态对食品安全具有重要意义。
[0003]通过测定白细胞介素6（IL
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6）和肿瘤坏死因子α(TNF
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α)在血清中的含量可评估家禽的健康状态。目前，临床常规应用的诊断方法大多为生化试剂法，即通过化学试剂与血清中的细胞因子发生生化反应，进而通过酶标仪进行测定，此类方法检测灵敏度低，且检出限受仪器精密性的影响。一些高端医疗机构使用多聚酶链式反应（PCR）检测，但数据仅能定性，无法准确进行定量，从而无法精准定位机体所处的健康状态。因此，我们需要一种新的检测手段，从而建立快速、敏感且高效的诊断技术，精准评价机体健康状态，既可实时监控家禽生长过程中的免疫状态，又能对早期疾病诊断提供有力指导。
[0004]近年来研究表明，荧光定量多聚酶链式反应（qPCR）可稳定应用于临床检测，它不但能有效地检测到各种疾病地发生发展，更能准确地定量疾病因子的含量。目前用此方法进行过遗传疾病相关、病毒相关和肿瘤相关的多种基因的表达检测，具有良好的特异性和稳定性，因此可有效地定出血清中的炎性因子的表达量，从而通过为家禽进行早期诊断而调整免疫策略提供思路。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种检测家禽血清炎症水平的试剂及其制备方法，主要针对当前传统诊断家禽免疫状态的缺点，如敏感性差(临床症状及染色法)，操作繁琐及时间长(生化试验法)，影响因素多，主观判定影响大(变态反应法)，使其能够快速诊断家禽炎症状态，从而实现家禽疾病的快速确诊、及时防控，用于克服现有技术中缺陷。
[0006]本专利技术采用的技术方案为：一种检测家禽血清炎症水平的试剂，所述的试剂由核
糖核酸（RNA）提取缓冲液、血清炎性因子特异性引物、内参基因引物、反转录体系反应液和荧光定量体系反应液组成，核糖核酸（RNA）提取缓冲液用于提取家禽血清样品制成总核糖核酸（Total RNA)，反转录体系反应液用于对总核糖核酸（Total RNA)进行反转录反应，血清炎性因子特异性引物和荧光定量体系反应液用于进行荧光定量多聚酶链式反应（qPCR）检测。
[0007]所述的糖核苷酸（RNA）提取缓冲液包括裂解液、氯仿、无水乙醇、糖核苷酸纯化缓冲液（RWT）、糖核苷酸边膜洗脱缓冲液（RPE）以及无菌无酶水。
[0008]所述的血清炎性因子特异性引物为肿瘤坏死因子α的特异性引物和细胞白介素6的特异性引物。
[0009]所述的内参基因为甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶（GAPDH）、β
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肌动蛋白（β
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actin）或核糖体核糖核酸（18s RNA）的一种或几种组成。
[0010]所述的反转录体系反应液包括5
×
反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合液、反转录酶、核糖核酸酶抑制剂、多聚胸腺嘧啶
‑
T重复寡核苷酸（Oligo(dT)20 VN）以及无菌无酶水，通过反转录体系反应步骤后可获得基因文库（cDNA）模板。所述的荧光定量体系反应液包括抗体法热启动聚合酶（SYBR qPCR Master Mix）和无菌无酶水。
[0011]上述的检测家禽血清炎症水平的试剂的制备方法，包括如下步骤：（1）采集家禽（代谢病、病毒病、细菌并均可）的血液样品，使用核糖核酸提取缓冲液对其进行总核糖核酸（Total RNA）提取；1）提取200 μL的家禽血清样品，并加入700 μL裂解液进行混匀，静置5分钟后加入140μL氯仿，并进行剧烈震荡，静置3分钟后放置到离心机上，在12000 rpm且4℃的温度下离心15分钟，取出上清液，并加入1.5倍体积的无水乙醇制成混匀液；3）将混合液放置到离心机上，在8000 rpm的条件下离心18秒，舍弃收集液，加入700μL 糖核苷酸纯化缓冲液（RWT），在8000 rpm的条件下离心18秒，再次舍弃收集液；4）加入500μL 核糖核酸边膜洗脱缓冲液（RPE），在8000 rpm的条件离心18秒，舍弃收集液，并重复2次操作；之后使用离心机全速离心1分钟；5）加入30
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60μL 无菌五无酶水，静置1分钟，8000 rpm离心1分钟；（2）总核糖核酸（Total RNA)反转录，1）提取健康家禽/患病家禽的总核糖核酸（Total RNA）2μL，加入无菌无酶水8 μL混匀制成10μL 的混合液，在65℃静置反应5min，并置于冰上骤冷2min；2)将该10μL 混合液、5
×
反应缓冲液4μL、脱氧核糖核苷三磷酸混合液1μL、反转录酶1μL、核糖核酸酶抑制剂1μL、多聚胸腺嘧啶
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T重复寡核苷酸（Oligo(dT)20 VN）1μL以及无菌无酶水2μL混合制成20μL反转录体系反应液，在25℃反应5min，37℃反应45min，85℃反应5s，并放置在4℃的温度下进行保存；（3）荧光定量反应，1)配置成10μL荧光定量体系反应液包括抗体法热启动聚合酶（SYBR qPCR Master Mix） 5μL、血清炎性因子特异性引物上下游各1μL、基因文库（cDNA）模板1μL以及无菌无酶水2μL；2）将配置的荧光定量体系反应液至于95℃预变性反应30s，通过95℃反应5s以及55 ~ 65℃反应30s使其配置的荧光定量体系进行变性反应，并将变性反应循环操作40次；3）变性反应后，通过95℃反应15s，60℃反应1 min，95℃反应15s，使其完成融解。
[0012]本专利技术有益效果是：本专利技术所述的试剂由核糖核酸（RNA）提取缓冲液、血清炎性因子特异性引物、内参基因引物、反转录体系反应液和荧光定量体系反应液组成，提供一种检测家禽血清炎症水平的试剂，主要针对当前传统诊断家禽免疫状态的缺点，如敏感性差(临床症状及染色法)，操作繁琐及时间长(生化试验法)，影响因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测家禽血清炎症水平的试剂，其特征在于：所述的试剂由核糖核酸（RNA）提取缓冲液、血清炎性因子特异性引物、内参基因引物、反转录体系反应液和荧光定量体系反应液组成，核糖核酸（RNA）提取缓冲液用于提取家禽血清样品制成总核糖核酸（Total RNA) ，反转录体系反应液用于对总核糖核酸（Total RNA)进行反转录反应，血清炎性因子特异性引物和荧光定量体系反应液用于进行荧光定量多聚酶链式反应（qPCR）检测。2.根据权利要求1所述的检测家禽血清炎症水平的试剂，其特征在于：所述的糖核苷酸（RNA）提取缓冲液包括裂解液、氯仿、无水乙醇、糖核苷酸纯化缓冲液（RWT）、糖核苷酸边膜洗脱缓冲液（RPE）以及无菌无酶水。3.根据权利要求1所述的检测家禽血清炎症水平的试剂，其特征在于：所述的血清炎性因子特异性引物为肿瘤坏死因子α的特异性引物和细胞白介素6的特异性引物。4.根据权利要求1所述的检测家禽血清炎症水平的试剂，其特征在于：所述的内参基因为甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶（GAPDH）、β
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肌动蛋白（β
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actin）或核糖体核糖核酸（18s RNA）的一种或几种组成。5.根据权利要求1所述的检测家禽血清炎症水平的试剂，其特征在于：所述的反转录体系反应液包括5
×
反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合液、反转录酶、核糖核酸酶抑制剂、多聚胸腺嘧啶
‑
T重复寡核苷酸（Oligo(dT)20 VN）以及无菌无酶水，通过反转录体系反应步骤后可获得基因文库（cDNA）模板。6.根据权利要求1所述的检测家禽血清炎症水平的试剂，其特征在于：所述的荧光定量体系反应液包括抗体法热启动聚合酶（SYBR qPCR Master Mix）和无菌无酶水。7.根据权利要求1
‑
6任意一项所述的检测家禽血清炎症水平的试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）采集家禽（代谢病、病毒病、细菌并均可）的血液样品，使用核糖核酸提取缓冲液对其进行总核糖核酸（Total...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘大庆，朱瑶，章子锋，阎林胤，
申请(专利权)人：北京健康广济生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：