一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的分子伴侣及其组合制造技术

本发明专利技术属于生物工程和食品领域，具体涉及提高α

【技术实现步骤摘要】
一种提高
α
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乳白蛋白在酵母菌中表达的分子伴侣及其组合


[0001]本专利技术属于生物工程和食品领域，具体涉及提高α
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乳白蛋白在酵母菌中表达的分子伴侣及其组合和其应用。

技术介绍

[0002]我国乳清蛋白依赖进口并且年进口量逐年攀升，亟需推动我国乳清蛋白类蛋白产品的生产研发。α
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乳白蛋白(alpha
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lactalbumin)是乳清蛋白中含量最高的蛋白质组分，也是牛乳清中第二大丰富的蛋白质。α
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乳白蛋白具备多种重要的生理功能，首先，作为小分子蛋白质，更易肠道吸收利用，有助于提高蛋白质的生物利用度，降低蛋白质总量，从而有效减轻肾脏负担；其次，α
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乳白蛋白含有丰富的色氨酸，色氨酸被认为是调节婴儿睡眠、情绪和食欲的重要氨基酸，有助于婴儿睡眠，促进大脑发育；另外，α
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乳白蛋白的水解肽段能够增强自身抵抗力，抗炎抗氧化，减少过敏反应发生；α
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乳白蛋白也是人体必需氨基酸的最佳来源，能促进神经发育，调节肠道的菌群平衡。基于其突出的生理和营养功能，α
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乳白蛋白成为国内外婴幼儿配方奶粉的重要原料，伊利乳业将α
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乳白蛋白配方作为其婴幼儿配方奶的专利组分。目前国内市场中乳白蛋白均为乳提取产品，实现α
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乳白蛋白的自主研发和微生物制造具有重要的战略意义。
[0003]α
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乳白蛋白的专利较少，相关专利表明目前已实现在大肠杆菌、酵母、藻类等体系中生产，例如US9732351B2、WOUS90007438。但现有技术中涉及的微生物生产α
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乳白蛋白的产量均较低，与乳提取产品的成本相比没有优势。中国专利CN114292324A(一种共表达分子伴侣蛋白生产α
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乳白蛋白的菌株及其应用)公布了一种在毕赤酵母中共表达分子伴侣以提高α
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乳白蛋白产量的方法。但存在的主要问题是：首先，产量不高，摇瓶发酵产量6.0mg/mL；其次，毕赤酵母的发酵培养需要添加有毒性的诱导物甲醇，是食品安全需要严格禁止的有毒有害物质，因此毕赤酵母不是我国获批的任何一种类型的食品安全菌株；另外，生产场所需要添加防爆设备，以保证发酵过程的安全，对发酵工艺要求高。
[0004]多数情况下，蛋白质折叠、内质网氧化应激反应、以及蛋白在内质网和高尔基体中转运过程常常成为外源蛋白分泌生产的瓶颈，这些过程涉及到数十种关键酶蛋白的独立或协同作用。基于转录组学分析等(https://doi.org/10.1002/biot.20160 0584)方法，已经鉴定出一系列对外源蛋白分泌有促进作用的分子伴侣和运输蛋白。

技术实现思路

[0005]本专利技术探索了一系列分子伴侣对乳酸克鲁维分泌表达α
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乳白蛋白的影响。通过研究，本专利技术以分泌表达α
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乳白蛋白的乳酸克鲁维酵母为出发菌株，通过过表达分子伴侣或其组合，促进α
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乳白蛋白在乳酸克鲁维表达系统中的正确折叠和高效分泌，增强α
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乳白蛋白的分泌表达。
[0006]本专利技术提供内质网分子伴侣蛋白KAR2、ERV2或SLY1。在增强酵母菌株表达α
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乳白蛋白的能力中的应用，其中内质网分子伴侣蛋白KAR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或
来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90％以上，95％以上，98％以上或99％以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白、ERV2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90％以上，95％以上，98％以上或99％以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白、SLY1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90％以上，95％以上，98％以上或99％以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白，优选地所述内质网分子伴侣蛋白KAR2与α
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乳白蛋白共表达；优选地，所述酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌。分子伴侣蛋白KAR2、ERV2或SLY1所述来源Kluyveromyces lactis，更具体来源于Kluyveromyces lactisvar.drosophilarum CBS 2105基因组。
[0007]本专利技术还提供一种内质网分子伴侣蛋白的组合在增强酵母菌株表达α
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乳白蛋白的能力中的应用，其中所述内质网分子伴侣蛋白的组合是下述分子伴侣之间的组合：
[0008]氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的钙联接蛋白CNE1；
[0009]氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的内质网氧化还原酶ERO1；
[0010]氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的FAD
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结合巯基氧化酶ERV2；
[0011]氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2；
[0012]氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的转录因子HAC1；
[0013]氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的KAR2；
[0014]氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的二硫键异构酶PDI；
[0015]氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的与高尔基体和细胞膜之间的囊泡运输相互作用的转运蛋白SEC1；
[0016]氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的调节内质网和高尔基体之间的转运蛋白SLY1；
[0017]氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的调节内质网的氧化应激的过氧化物歧化酶SOD1；
[0018]氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的糖基转移酶STT3；
[0019]或者来源Kluyveromyces lactis且与上述各序列号所示氨基酸序列具有90％以上，95％以上，98％以上或99％以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白。
[0020]优选地，所述组合为两个分子伴侣蛋白的组合。
[0021]优选地，所述内质网分子伴侣蛋白的组合是分子伴侣KAR2、ERV2或SLY1之间的两两组合；
[0022]优选地，内质网分子伴侣蛋白的组合与α
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乳白蛋白共表达；
[0023]优选地，所述酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌。
[0024]更具体地，所述内质网分子伴侣蛋白KAR2与其他分子伴侣的组合是串联连接，优选地通过自裂解肽2A作为连接肽进行连接，例如F2A的氨基酸序列长度75bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13；
[0025]优选地，所述的α
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乳白蛋白来源牛Bostaurus，更优选地，其核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内质网分子伴侣蛋白KAR2、ERV2或SLY1在增强酵母菌株表达α
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乳白蛋白的能力中的应用，其中内质网分子伴侣蛋白KAR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白、ERV2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白、SLY1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示或来源Kluyveromyces lactis且与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白，优选地所述内质网分子伴侣蛋白KAR2与α
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乳白蛋白共表达；优选地，所述酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌。2.一种内质网分子伴侣蛋白的组合在增强酵母菌株表达α
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乳白蛋白的能力中的应用，其中所述内质网分子伴侣蛋白的组合是下述分子伴侣之间的组合：氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的KAR2；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的钙联接蛋白CNE1；氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的内质网氧化还原酶ERO1；氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的FAD
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结合巯基氧化酶ERV2；氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2；氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的转录因子HAC1；氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的二硫键异构酶PDI；氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的与高尔基体和细胞膜之间的囊泡运输相互作用的转运蛋白SEC1；氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的调节内质网和高尔基体之间的转运蛋白SLY1；氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的调节内质网的氧化应激的过氧化物歧化酶SOD1；氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的糖基转移酶STT3；或者来源Kluyveromyces lactis且与上述各序列号所示氨基酸序列具有90%以上，95%以上，98%以上或99%以上的同一性且仍具有分子伴侣功能的蛋白；优选地，所述组合为两个分子伴侣蛋白的组合。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述内质网分子伴侣蛋白的组合是分子伴侣KAR2、ERV2或SLY1之间的两两组合；优选地，内质网分子伴侣蛋白的组合与α
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乳白蛋白共表达；优选地，所述酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌。4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述内质网分子伴侣蛋白的组合是串联连接，优选地通过自裂解肽2A作为连接肽进行连接，例如F2A的氨基酸序列长度75 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13；优选地，所述的α
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乳白蛋白来源牛Bostaurus，更优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。5.一种含有分...

【专利技术属性】
技术研发人员：马延和，郑迎迎，刘文婷，商娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：