一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用，涉及蛋白质工程技术领域。本发明专利技术提供了一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，包括由酵母启动子

【技术实现步骤摘要】
一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用


[0001]本专利技术涉及蛋白质工程
，具体涉及一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用。

技术介绍

[0002]目前比较成熟的展示技术主要包括噬菌体展示技术和酵母展示技术。酵母展示技术被认为是更优于噬菌体展示的蛋白体外筛选技术。酵母展示技术是基于将目的蛋白展示于酵母细胞表面的通用技术，广泛应用于许多生物领域。其基本原理是将外源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的质粒载体基因序列融合后转化到酵母细胞内，融合蛋白含有可锚定在酵母细胞壁上的结构，经转录翻译后可将外源蛋白固定化表达在酵母细胞表面。
[0003]酵母展示技术具有多项优点：酵母表达系统不仅具有操作简单，培养方便等原核生物细菌表达系统的特点，并且由于其属于真核生物系统，具备了蛋白翻译后加工和修饰的功能，使得表达出来的蛋白、抗体、酶等更接近天然结构。酵母细胞的直径比细菌大2
‑
5倍，这使得酵母展示技术的筛选不仅适用于磁珠筛选(MACS)，还可以和流式细胞仪(FACS)结合起来，不但提高筛选的通量和速度，并且可以非常直观跟踪和预估抗体亲和力，极大地提高筛选效率。而且，酵母在生长传代过程中可以使基因文库的多样性得到很好的保真，避免基因文库的偏向性。
[0004]酵母表面展示技术已成为蛋白质工程，尤其是抗体工程中广泛应用的强大工具。其中酵母展示技术可以结合流式细胞术，直接分析展示靶标蛋白的表达、稳定性以及与互作蛋白的亲和力，从而成为高效的文库筛选体系。酵母表面展示技术已被用于针对各种抗原的纳米抗体(VHH)和单链抗体(scFv)筛选及其优化。
[0005]酵母展示技术相比噬菌体展示技术有着非常突出的优点，但同时也有其明显的不足之处。如野生型酵母由于其锚定蛋白表达水平低，无法有效展示靶标蛋白，必须高表达锚定蛋白才能有效展示靶标蛋白。酵母种类繁多，在不同的应用领域通常会选用更适合本领域的酵母菌株，但目前常用的能高表达锚定蛋白的酵母菌株只有酿酒酵母EBY100及其衍生菌株。目前，酵母展示质粒载体只能展示靶标蛋白，没有同时也高效表达锚定蛋白的质粒载体，锚定蛋白由EBY100的基因组表达元件提供，这就极大的限制了酵母展示技术使用的广泛性和方便性。因此，本领域亟需一种使用方便而且具有通用型的酵母细胞表面展示质粒载体。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，可以使靶标蛋白高效地在大多数类型的酵母细胞表面进行展示，极大的提高酵母表面展示技术的使用方便性和广泛性。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，所述质粒载体包括：由酵
母启动子
‑
酵母Aga1基因
‑
酵母转录终止子组成的表达模块一和由酵母启动子
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展示基因
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Aga2p基因
‑
酵母转录终止子组成的表达模块二。
[0009]优选的，所述酵母启动子为GAL1
‑
GAL10双向启动子、GAP/TDH3启动子、TEF1启动子、TEF2启动子、CCW12启动子、PGK1启动子、TPI1启动子、HHF2启动子中的任意一种。
[0010]优选的，所述酵母转录终止子为Cyc1终止子、ADH1终止子、PGK1终止子、ENO1终止子、ENO2终止子、SSA1终止子、TDH1终止子、RPL3终止子中的任意一种。
[0011]优选的，所述质粒载体还包括在大肠杆菌中进行复制和筛选的元件；所述在大肠杆菌中进行复制的元件为ColE1 ori、P15A ori、CloDF13 ori、RSF1030 ori、COLA或Mini
‑
F/RK2中的任意一种；所述在大肠杆菌中进行筛选的元件为氨苄霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因或四环素抗性基因中的任意一种。
[0012]优选的，所述质粒载体还包括在酵母细胞中进行复制和筛选的元件；所述在酵母细胞中进行复制的元件为CEN/ARS或2μm Ori；所述在酵母细胞中进行筛选的元件为URA3、His、Trp、Leu或Ile中的任意一种。
[0013]优选的，所述展示基因为多肽、纳米抗体、人源化抗体scFv、TCR或酶中的任意一种。
[0014]优选的，所述酵母Aga1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]优选的，所述Aga2p基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016]优选的，所述酵母细胞表面展示质粒载体不依赖于特定酵母菌株；所述酵母菌株包括：酿酒酵母、己氏酵母、贝酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、白色假丝酵母、毕赤酵母、树干毕赤酵母、解脂耶氏酵母、多形汉逊酵母、红法夫酵母、产航假丝酵母、耐盐酵母、汉逊德己利酵母、多形德己利酵母、粟酒裂殖酵母、西方许旺酵母或其衍生物。
[0017]本专利技术还提供了上述的酵母细胞表面展示质粒载体在靶标蛋白展示中的应用。
[0018]本专利技术提供了一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，将锚定蛋白和靶标蛋白同时构建在同一个质粒载体上，使其在酵母细胞内同时实现高效表达，从而使靶标蛋白可以高效地在大多数类型的酵母细胞表面进行展示。本专利技术所述质粒载体不依赖任何特定的酵母细胞菌株，可以在多种酵母菌株中进行细胞表达展示，具有显著的通用型特征，可以广泛应用于多肽，抗体scFv，TCR，酶等多种靶标蛋白的展示，极大的提高酵母表面展示技术的使用方便性和广泛性。
附图说明
[0019]图1为pSBT
‑
YD2图谱质粒图谱。
[0020]图2为pSBT
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YD4图谱质粒图谱。
[0021]图3为anti CD47 scFv展示检测方法示意图。
[0022]图4为实施例2蛋白展示表达结果；其中，A和B为荧光视野下观察荧光情况，C和D为亮视野下观察细胞状态，A和C为半乳糖无诱导结果，B和D为半乳糖诱导结果。
[0023]图5为实施例3蛋白展示表达结果；其中，A为荧光视野下观察荧光情况，B为亮视野下观察细胞状态。
[0024]图6为VHH抗体对靶蛋白CD47的结合能力结果；其中，A为ELISA验证板孔图，从左到
右抗体梯度稀释(抗体起始浓度为0.2μg/ul)依次为1、10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8、10
‑9、10
‑
10
，抗原的包被浓度为5ug/ml,#1，#2为不同浓度的抗体的复孔实验显色情况，B为ELISA验证OD450数值图。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，所述质粒载体包括：由酵母启动子...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，其特征在于，所述质粒载体包括：由酵母启动子
‑
酵母Aga1基因
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酵母转录终止子组成的表达模块一和由酵母启动子
‑
展示基因
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Aga2p基因
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酵母转录终止子组成的表达模块二。2.根据权利要求1所述的通用型酵母细胞表面展示质粒载体，其特征在于，所述酵母启动子为GAL1
‑
GAL10双向启动子、GAP/TDH3启动子、TEF1启动子、TEF2启动子、CCW12启动子、PGK1启动子、TPI1启动子、HHF2启动子中的任意一种。3.根据权利要求1所述的通用型酵母细胞表面展示质粒载体，其特征在于，所述酵母转录终止子为Cyc1终止子、ADH1终止子、PGK1终止子、ENO1终止子、ENO2终止子、SSA1终止子、TDH1终止子、RPL3终止子中的任意一种。4.根据权利要求1所述的通用型酵母细胞表面展示质粒载体，其特征在于，所述质粒载体还包括在大肠杆菌中进行复制和筛选的元件；所述在大肠杆菌中进行复制的元件为ColE1 ori、P15A ori、CloDF13 ori、RSF1030 ori、COLA或Mini
‑
F/RK2中的任意一种；所述在大肠杆菌中进行筛选的元件为氨苄霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳伟强，张斌，黄国帅，杨平，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：