一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术适用于微生物代谢及合成生物学领域，提供了一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，其中，高产檀香醇的酿酒酵母工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，过表达IME4、tHMGR、UPC2

【技术实现步骤摘要】
一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于微生物代谢及合成生物学领域，尤其涉及一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]檀香挥发油是檀香的最重要成分，提取自檀香科植物檀香(Santalum album L.)的干燥心材。药典(2015版)规定，其含量不得少于3.0％(mL/g)。檀香挥发油的主要成分为倍半萜类化合物，α
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檀香醇、β
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檀香醇、α
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檀香烯和β
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檀香烯等四种成分占檀香挥发油比重的95％以上。檀香挥发油中，α
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檀香醇和β
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檀香醇是指标成分，国际标准要求二者的含量要分别达到41
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55％和16
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24％。
[0003]现代医学表明，檀香挥发油具有多种药用功效，如抗炎、解热、抗氧化、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤等。同时，檀香挥发油具有重要的经济价值：(1)檀香挥发油是世界公认的高级化妆品的名贵原料，被广泛用于各种化妆品的制作，如洁面乳、爽肤水、面霜、眼霜、面膜、乳液、洗发水、沐浴露、润体乳和香皂等；(2)檀香挥发油中的α
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檀香醇和β
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檀香醇能够产生特殊的香味，已成为香水最珍贵的成分，现有的大约7000种经典香水中，有46％都含有檀香挥发油；(3)檀香挥发油独有的香气可安抚神经、提神静心，能够缓解忧郁、焦虑和神经紧张等的症状，被誉为“精油之帝”，可通过蒸汽吸入、按摩、涂抹、泡澡和熏香等方式应用于芳香疗法。
[0004]目前，檀香挥发油只能从檀香的心材中蒸馏提取，但檀香为半寄生植物，不能离开寄主独立生存，其生长条件严苛，生长周期长，只有20年以上树木的心材才能达到品质要求。因此，利用合成生物学的手段，通过微生物细胞工厂进行制备，是解决这一高价值成分的有效方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术实施例的目的在于提供一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，旨在解决
技术介绍
中提出的问题。
[0006]针对上述问题，本专利技术实施例是这样实现的，一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其中，所述高产檀香醇的酿酒酵母工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，过表达IME4、tHMGR、UPC2
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1、SaSS、CYP736A167和AtCPR1基因，敲低ERG9基因；其中，IME4基因的启动子替换为组成型强启动子PGK1p；tH MGR和UPC2
‑
1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；ERG9基因的启动子替换为半乳糖抑制型启动子HXT1p；SaSS、CYP736A167和AtCPR1基因整合到酿酒酵母染色体的TY2位点；
[0007]所述构建方法具体包括以下步骤：
[0008]将筛选标记MET和启动子PGK1p连接，构建基因表达模块MET
‑
PGK1p，命名为模块I；
[0009]将GAL1p、tHMGR和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p
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tHMGR
‑
AD H1t，命名为模块II；
[0010]将GAL10p、UPC2
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1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p
‑
UPC2
‑1‑
CYC1t，命名为模块III；
[0011]将模块II和模块III连接，构建基因表达模块GAL1p
‑
tHMGR
‑
ADH1t
‑
GAL10p
‑
UPC2
‑1‑
CYC1t，命名为模块IV；
[0012]将筛选标记HIS和启动子HXT1p连接，构建基因表达模块HIS
‑
HXT1p，命名为模块V；
[0013]将GAL1p、SaSS和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p
‑
SaSS
‑
ADH1t，命名为模块VI；
[0014]将GAL1p、CYP736A167和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p
‑
CYP736A167
‑
ADH1t，命名为模块VII；
[0015]将GAL10p、AtCPR1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p
‑
AtCPR1
‑
CYC1t，命名为模块VIII；
[0016]将模块VII和模块VIII连接，构建基因表达模块GAL1p
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CYP736A167
‑
ADH1t
‑
GAL10p
‑
AtCPR1
‑
CYC1t，命名为模块IX；
[0017]将模块I转化酵母工程菌，得到菌株TX01；
[0018]将模块IV插入到载体pCfB2875的SfaSI酶切位点，得到整合表达载体pCf B2875
‑
III；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合表达载体pCfB2875
‑
III，得到DNA整合片段S1；再将DNA整合片段S1整合到酵母工程菌染色体的TY3位点，得到菌株TX02；
[0019]将pSH65载体(武汉淼灵生物科技有限公司)转化菌株TX02，并进行筛选(具体可以用含有80
‑
120μg/mL博来霉素的YPD固体培养基进行筛选)，得到菌株TX03；
[0020]将模块V转化酵母工程菌TX03，得到菌株TX04；
[0021]将模块VI插入到载体pCfB2797的SfaSI酶切位点，得到整合表达载体pCf B2797
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VI；将模块IX插入到载体pCfB2797
‑
VI的NheI酶切位点，得到整合表达载体pCfB2797
‑
VI
‑
IX；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合表达载体pCfB2797
‑
VI
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IX，得到DNA整合片段S2；再将DNA整合片段S2整合到菌株TX04染色体的TY2位点，得到所述高产檀香醇的酿酒酵母工程菌；
[0022]其中，所述UPC2
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1基因是基于PCR的定点突变技术将转录因子基因UPC2突变为UPC2
‑
1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的tHMGR和UPC2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1
‑
2所示；所述的SaSS和CYP736A167基因为檀香中的檀香烯合酶和檀香醇合酶经密码子优化而来，其核苷酸序列如S EQ ID NO.4
‑
5所示；所述的AtCPR1基因为拟南芥中的细胞色素P450酶的还原酶经密码子优化而来，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PGK1p、HXT1p本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产檀香醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述高产檀香醇的酿酒酵母工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，过表达IME4、tHMGR、UPC2
‑
1、SaSS、CYP736A167和AtCPR1基因，敲低ERG9基因；其中，IME4基因的启动子替换为组成型强启动子PGK1p；tHMGR和UPC2
‑
1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；ERG9基因的启动子替换为半乳糖抑制型启动子HXT1p；SaSS、CYP736A167和AtCPR1基因整合到酿酒酵母染色体的TY2位点；所述构建方法具体包括以下步骤：将筛选标记MET和启动子PGK1p连接，构建基因表达模块MET
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PGK1p，命名为模块I；将GAL1p、tHMGR和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p
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tHMGR
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AD H1t，命名为模块II；将GAL10p、UPC2
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1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p
‑
UPC2
‑1‑
CYC1t，命名为模块III；将模块II和模块III连接，构建基因表达模块GAL1p
‑
tHMGR
‑
ADH1t
‑
GAL10p
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UPC2
‑1‑
CYC1t，命名为模块IV；将筛选标记HIS和启动子HXT1p连接，构建基因表达模块HIS
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HXT1p，命名为模块V；将GAL1p、SaSS和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p
‑
SaSS
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ADH1t，命名为模块VI；将GAL1p、CYP736A167和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p
‑
CYP736A167
‑
ADH1t，命名为模块VII；将GAL10p、AtCPR1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p
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AtCPR1
‑
CYC1t，命名为模块VIII；将模块VII和模块VIII连接，构建基因表达模块GAL1p
‑
CYP736A167
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ADH1t
‑
GAL10p
‑
AtCPR1
‑
CYC1t，命名为模块IX；将模块I转化酵母工程菌，得到菌株TX01；将模块IV插入到载体pCfB2875的SfaSI酶切位点，得到整合表达载体pCf B2875
‑
III；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合表达载体pCfB2875
‑
III，得到D...

【专利技术属性】
技术研发人员：李德芳，安天悦，王国丽，傅蓉，
申请(专利权)人：安天悦，
类型：发明
国别省市：