一种登革四价mRNA疫苗、脂质体纳米粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及一种登革四价mRNA疫苗、脂质体纳米粒及其制备方法和应用。本发明专利技术提供了一种编码脂质纳米粒包裹的串联四种血清型DENV的EDIII结构蛋白与含有多个TBT表位的多肽的mRNA疫苗(mRNA

【技术实现步骤摘要】
一种登革四价mRNA疫苗、脂质体纳米粒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及疫苗制备
，尤其涉及一种登革四价mRNA疫苗、脂质体纳米粒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]登革热病毒(DENV)是最常见的媒介传播病毒疾病，是黄病毒科的成员，寨卡病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒和日本脑炎病毒也是该科的成员。它是通过节肢动物媒介埃及伊蚊传播的，白纹伊蚊传播的程度要小得多。该病毒含有一个单链、阳性的RNA基因组，编码一个含有三种结构蛋白的单一多肽，即膜前蛋白(PRM)、包膜蛋白(E)和衣壳蛋白(C)，以及七种非结构蛋白。登革热病毒分为四个不同的血清型，即登革热血清型1至4型(DENV
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1至DENV
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4)，登革热流行的大多数国家都受到所有四种血清型的影响它主要在热带、亚热带地区流行。
[0003]登革热感染期间的疾病状态表现为一系列严重程度，从自限性、发热性疾病到更严重的血管渗漏，这些渗漏可能导致与病毒驱动的细胞因子风暴相关的多器官衰竭，迄今没有针对登革热的特效药物可用。值得注意的是，患者初次感染单一血清型的DENV后，可以诱导对同型DENV的长期免疫，但随后感染异型DENV会增加发展为严重登革热的风险。这是因为初次感染后的体液免疫反应会产生交叉反应的非中和抗体，这些抗体可以通过抗体依赖增强(ADE)与来自二次异型攻击的感染性病毒颗粒结合，并导致具有Fcγ受体的细胞感染增加。这对疫苗研发提出了挑战，因为一种成功的疫苗必须引起对所有四种血清型DENV平衡的中和、持久的免疫反应。
[0004]临床评估进展最大的DENV疫苗包括CYD
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TDV(赛诺菲
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巴斯德)、TAK
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003(DENV
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AX；武田)和TV
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003(NIAID/NIH)。这三种疫苗都是减毒活疫苗，但减毒活疫苗存在毒力回复风险，有安全性隐患，易引发ADE效应。并且最容易出现严重登革热相关症状的人群无法接种。截至目前，登革病毒疫苗在核酸疫苗领域的研发略为滞后，有实验团队研发出针对某一种或两种血清型登革病毒核酸疫苗，他们能激起小鼠体内产生针对这一两种血清型病毒的特异性体液、细胞免疫，但没有研发出能针对四种血清型登革病毒的疫苗，并且登革病毒核酸疫苗的研究仅停留在临床前阶段。
[0005]因此，如何提供一种能针对四种血清型登革病毒的疫苗，以解决现有技术中缺少相应登革病毒核酸疫苗的技术问题，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种登革四价mRNA疫苗、脂质体纳米粒及其制备方法，用修饰的假尿嘧啶在体外转录了编码EDIII与TBT的mRNA，并将其包装成脂质纳米粒(LNP)。在野生型BALB/c小鼠中接种针对4种血清型DENV mRNA
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LNP疫苗可产生针对4种血清型登革病毒的特异性IgG抗体，并且诱导出具有保护效应的中和抗体和抗病毒特异性T细胞免疫，效果优异。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种登革四价mRNA疫苗，包括用于表达登革病毒的免疫原的mRNA，所述mRNA的序列由SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术还提供了一种脂质体纳米粒，所述的mRNA被包裹在脂质体中，从而构成脂质体纳米粒。
[0010]优选的，所述的脂质体纳米粒的平均粒径为80～120nm。
[0011]本专利技术还提供了所述的脂质体纳米粒的制备方法，将SM
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102、DSPC、胆固醇、DMG
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PEG2000和无水乙醇混合，静置，得脂质体溶液，将脂质体溶液和mRNA溶液分别添加到T型管中的有机相管道与无机相管道，得到水相mRNA和脂质相，然后将水相mRNA与脂质相混合。
[0012]优选的，所述SM
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102、DSPC、胆固醇和DMG
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PEG2000的摩尔比为40～60：8～12：28.5～48.5：1～2。
[0013]优选的，所述SM
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102、DSPC、胆固醇和DMG
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PEG2000溶于无水乙醇，其溶解后浓度分别为23.8mg/mL、5.86mg/mL、11.04mg/mL、2.78mg/mL。
[0014]优选的，所述mRNA溶液以柠檬酸盐缓冲液为溶剂，所述柠檬酸盐缓冲液的浓度为40～60mM。
[0015]优选的，以水相mRNA与脂质相的流速比为3：0.5～1.5。
[0016]优选的，所述mRNA溶液中mRNA的浓度为0.15～0.19mg/mL。
[0017]本专利技术还进一步的提供了所述的登革四价mRNA疫苗，所述的脂质体纳米粒，所述的脂质体纳米粒的制备方法制备得到的脂质体纳米粒在制备治疗登革病毒药物中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
[0019]1、本专利技术提供了一种针对四种血清型DENV的mRNA疫苗，用修饰的假尿嘧啶在体外转录了编码EDIII与TBT的mRNA，并将其包装成脂质纳米粒(LNP)。肌肉注射后，mRNA
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LNP被带入注射部位的肌肉细胞，以及引流淋巴结中的抗原提呈细胞。一旦细胞内吞了mRNA
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LNP，LNP就会在酸化的内体中降解，将mRNA释放到细胞质中。
[0020]然后，mRNA被翻译成病毒EDIII蛋白与TBT多肽。EDIII蛋白与TBT多肽被嵌入内质网(ER)的膜中，并被宿主蛋白酶切割成能被主要组织相容性复合体识别的片段，而后被主要组织相容性复合体递呈给CD4
+
/CD8
+
T细胞从而激发免疫反应。在野生型BALB/c小鼠中接种针对4种血清型DENV mRNA
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LNP疫苗可产生针对4种血清型登革病毒的特异性IgG抗体，并且诱导出具有保护效应的中和抗体和抗病毒特异性T细胞免疫。
[0021]2、严重的登革热并发症通常与四种循环血清型之一的继发性异型感染有关。在这种情况下，针对交叉反应、中和能力差的表位的体液免疫反应可以通过抗体依赖增强(ADE)导致易感细胞的传染性增加，通过这种方式，在感染或接种疫苗后产生的抗体能够在随后的感染中促进疾病的加重。目前没有可用的治疗方法来对抗登革病毒引发的疾病，因此迫切需要开发一种安全有效的疫苗。
[0022]在这里，本专利技术开发了一种编码脂质纳米粒包裹的串联四种血清型DENV的EDIII结构蛋白与含有多个TBT表位的多肽的mRNA疫苗(mRNA
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LNP)。小鼠接种疫苗后，产生了具有针对四种血清型登革病毒的高水平的特异性体液免疫、细胞免疫，也产生了具有中和作用的抗体。免疫后血清可保护3日龄乳鼠免受致死性DENV攻击，说明疫苗产生的中和抗体足以抵御致命的挑战，这是一种可用于长久研究的有效疫苗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种登革四价mRNA疫苗，其特征在于，包括用于表达登革病毒的免疫原的mRNA，所述mRNA的核苷酸序列由SEQ ID NO 1所示。2.一种脂质体纳米粒，其特征在于，所述的mRNA被包裹在脂质体中，从而构成脂质体纳米粒。3.根据权利要求2所述的脂质体纳米粒，其特征在于，所述的脂质体纳米粒的平均粒径为80～120nm。4.权利要求2或3所述的脂质体纳米粒的制备方法，其特征在于，将SM
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102、DSPC、胆固醇、DMG
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PEG2000和无水乙醇混合，静置，得脂质体溶液，将脂质体溶液和mRNA溶液分别添加到T型管中的有机相管道与无机相管道，得到脂质相和水相mRNA，然后将水相mRNA与脂质相混合。5.根据权利要求4所述的脂质体纳米粒的制备方法，其特征在于，所述SM
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102、DSPC、胆固醇和DMG
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PEG2000的摩尔比为40～60：8～12：28.5～48...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晋涛，丁晓艳，周伃欣，全纹萱，何久香，华栋，柳敏驰，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：