结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法、检测猴痘病毒核酸的试剂盒以及制备方法包括以下步骤：获取猴痘病毒的基因组序列，通过生物信息学分析对比，寻找其特异性鉴定区域；设计得到检测猴痘病毒核酸的crRNA

【技术实现步骤摘要】
结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法。

技术介绍

[0002]随着病毒检测技术日益发展，现有的猴痘病毒的检测手段主要有形态学观察、血清学检测和分子生物学方法等。由于血清学诊断和临床诊断敏感性较低，病毒感染的快速特异性诊断主要采用分子诊断(PCR或real
‑
time PCR)，然而real
‑
time PCR技术对环境要求严格，仪器昂贵，不适合现场检测。近年来，利用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR
‑
Cas系统进行病原体检测在提高检测灵敏度的同时，可以大大缩短检测时间和对现场的仪器要求，但还没有应用到猴痘病毒(MPXV)的检测中。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足和填补空白，提供可以检测猴痘病毒核酸(MPXV)的crRNA以及试剂盒。
[0004]为达成上述目的，本专利技术第一个技术方案如下：一种结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法，包括如下步骤：
[0005]步骤1)：样品的特定片段经过特异性引物的RPA扩增；
[0006]步骤2)：上一步扩增得到的含有病毒模板片段的混合物与含有Cas12a酶、crRNA的系统混合，并加入检测探针；
[0007]步骤3)：不同的探针发出的信号分别被便携式荧光恒温放大器捕捉与放大，通过荧光值对结果进行判读。
[0008]本专利技术的第二个技术方案：一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒，包括检测猴痘病毒核酸的crRNA
‑
1或者crRNA
‑
2、LbCas12a核酸酶、核酸检测探针、引物对以及Basic试剂盒、DEPC水和10X NEBuffer
TM r2.1。
[0009]本专利技术的第三个技术方案：一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒制备方法，包括如下步骤：
[0010]1)获取猴痘病毒MPXV的基因组序列，通过生物信息学分析对比，寻找其特异性鉴定区域；
[0011]2)设计得到检测猴痘病毒核酸的crRNA
‑
1、crRNA
‑
2：
[0012]crRNA
‑
1序列为taatttctactaagtgtagatttggaaaggtgttaaccctgtcac；
[0013]crRNA
‑
2序列为taatttctactaagtgtagatgtatataagttgtacggctaattc；
[0014]3)试剂盒的具体操作步骤如下：
[0015]在39℃条件下，RPA扩增MPXV F3L和B6R基因；
[0016]取上述体系加入Cas12a系统，crRNA与dsDNA进行识别并结合，并激活Cas12a酶活
性；Cas12a酶随机切割ssDNA FQ探针；
[0017]荧光恒温放大器捕捉荧光信号，输出结果。
[0018]进一步，所述步骤1)具体步骤包括：在NCBI核酸序列库查找猴痘病毒MPXV的全基因组序列，锁定相对保守的F3L和B6R基因作为鉴定基因，寻找“TTTN”序列，将这些序列作为crRNA靶向序列的备选数据库，与其它正痘病毒属病毒相比,寻找备选数据库的中序列的特异性。
[0019]进一步，所述步骤2)具体步骤包括：根据筛选原则包含的序列的GC含量、碱基均一性、序列保守性参数,最终得到一段大小为20
‑
24nt的靶位点识别序列,然后将一段大小为20
‑
21nt的直接重复序列加上前述得到的大小为20
‑
24nt的靶位点识别序列得到检测MPXV核酸的crRNA,共得到2条,分别为crRNA
‑
1和crRNA
‑
2。
[0020]进一步，所述步骤3)具体步骤包括：
[0021](1)用重组酶聚合酶RPA扩增试剂盒扩增目的片段，取2.2
‑
2.5μL上游引物(F3L:TAGGAGAGTTACTAGGCCCCAC；B6R:CTAATGCGGAATGTCAACCTCTTCAA)，2.2
‑
2.5μL下游引物(F3L:ACGACAATGGATGCTGATACAC；B6R:AGAAAATGTAGATCCGGAAATTAATC)(10μmol/L)，反应缓冲液，活化剂，加入DNA模板和水的混合物，37
‑
42℃孵育；
[0022](2)取crRNA和缓冲液与Cas12a孵育，在20
‑
28℃下放置，充分混合；
[0023](3)将RPA反应体系和ssDNA FQ探针加入到CRISPR/Cas12a混合体系中，反应在GS8等温循环仪中进行放置，荧光测量；
[0024](4)CRISPR/Cas12a结合RPA系统检测F3L和B6R基因的灵敏度，读取相对荧光值。
[0025]本专利技术的有益效果表现如下
[0026]1、为了便于早期疑似感染病例的准确诊断和快速稳定地检测样本，我们设计了一种RPA与CRISPR
‑
Cas12a相结合的猴痘病毒核酸检测试剂盒，可以快速、灵敏地检测MPXV。该检测系统可在30
‑
40min内检测MPXV基因组DNA，检测限为1copy/μL。
[0027]2、本专利技术将CRISPR/Cas12a方法与荧光恒温放大器相结合，减少了现场检测对大型设备的依赖，形成了一种高灵敏度、低成本的MPXV检测工具。
附图说明
[0028]图1为本专利技术的一种检测猴痘病毒核酸的流程图；
[0029]图2为本专利技术选定的MPXV目的基因与其他病毒同源片段比对图；
[0030]图3为本专利技术所设计的crRNA和引物的序列示意图；
[0031]图4为本专利技术使用便携式荧光恒温放大器(GS8等温循环仪)检测MPXV目的基因数据的示意图；
[0032]图5为本专利技术的检测MPXV片段的灵敏度示意图。
具体实施方式
[0033]以下结合附图以及具体实施方式，对本专利技术作进一步详细说明。
[0034]本专利技术一种结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法，包括如下步骤：
[0035]步骤1)：样品的特定片段经过特异性引物的RPA扩增；
[0036]步骤2)：上一步扩增得到的含有病毒模板片段的混合物与含有Cas12a酶、crRNA的
系统混合，并加入检测探针；
[0037]步骤3)：不同的探针发出的信号分别被便携式荧光恒温放大器捕捉与放大，通过荧光值对结果进行判读
[0038]本专利技术提供了一种检测猴痘病毒(MPXV)核酸的试剂盒，包括检测猴痘病毒核酸的crRNA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1)：样品的特定片段经过特异性引物的RPA扩增；步骤2)：上一步扩增得到的含有病毒模板片段的混合物与含有Cas12a酶、crRNA的系统混合，并加入检测探针；步骤3)：不同的探针发出的信号分别被便携式荧光恒温放大器捕捉与放大，通过荧光值对结果进行判读。2.一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒，其特征在于，包括检测猴痘病毒核酸的crRNA
‑
1或者crRNA
‑
2、LbCas12a核酸酶、核酸检测探针、引物对以及Basic试剂盒、DEPC水和10X NEBuffer
TM
r2.1。3.一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)获取猴痘病毒MPXV的基因组序列，通过生物信息学分析对比，寻找其特异性鉴定区域；2)设计得到检测猴痘病毒核酸的crRNA
‑
1、crRNA
‑
2；3)试剂盒的具体操作步骤如下：RPA扩增MPXV F3L和B6R基因；取上述体系加入Cas12a系统，crRNA与dsDNA进行识别并结合，并激活Cas12a酶活性；Cas12a酶随机切割ssDNA FQ探针；荧光恒温放大器捕捉荧光信号，输出结果。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体步骤包括：在NCBI核酸序列库查找猴痘病毒MPXV的全基因组序列，锁定相对保守的F3L和B6R基因作为鉴定基因，寻找“TTTN”序列，将这些序列作为crRNA靶向序列的备选数据库，与其它正痘病毒属病毒相比,寻找备选数据库的中序列的特异性。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)具体步骤包括：根据筛选原则包含的序列的GC含量、碱基均一性、序列保守性参数,最终得到一段大小为20
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，李斐斐，黄梦倩，刘思华，王志云，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：