HIV-1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供了一种HIV

【技术实现步骤摘要】
HIV
‑
1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种HIV
‑
1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的检测方法。

技术介绍

[0002]艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是一种由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染CD4
+
T淋巴细胞导致机体免疫功能下降而引起的慢性传染性疾病。抗逆转录病毒治疗(Antiretroviral therapy,ART)作为一种降低HIV感染者死亡、减少HIV传播的有效手段，正在全球范围广泛推行。然而由于HIV具有高度的遗传变异性和极快的病毒复制速率，导致HIV容易出现耐药突变并在药物选择压力下成为优势毒株，进而导致HIV感染者对抗病毒治疗药物耐药。
[0003]目前HIV基因型耐药检测方法多采用一代测序检测耐药突变位点。该方法通过双脱氧核苷酸末端终止法进行测序，由Sanger等人于1977年专利技术，又称Sanger测序法(Sanger sequencing，SS)。Sanger测序一直是流行病学调查或临床中HIV耐药检测的通用方法，但此方法的检测通量较低，且只能检测准种中比例在20％以上的突变株，很难检测劣势株，因此近些年来，国际上一直在寻求新的、高通量和高灵敏度的替代检测方法。
[0004]二代测序，也称下一代测序(Next generation sequence，NGS)，最早于2005年专利技术。Roche公司研发的454测序平台，基于光纤微流体技术和包裹待测DNA片段的乳化液滴技术，是第一个商业化的平台，标志着二代测序技术时代的到来。该平台具有检测速度快、灵敏度高、长读取的优势，读长可以达到700bp，但其错误率高达4％，难以精确检测病毒准种间的细微差别。2006年，Solexa公司研发了GA测序仪，利用边合成边测序的原理，实现了核酸的大规模平行测序。基于GA平台，Illumina研发了一系列测序平台，极大地提高了二代测序的效率，并进一步降低了错误率。其中MiSeq平台可进行双端测序，可获得长达600bp的读长，且运行成本较低，便于小型微生物，包括病毒和细菌基因组的测序，是目前应用最广泛的二代测序平台之一。
[0005]尽管NGS应用前景很好，但是现有技术中并没有一种可靠的使用NGS检测HIV特定区域基因型的方法，并未如预测的那样实现检测的快速常规化，以往基于扩增子建库的NGS方法测出的文库浓度低，测序深度低，且基因型的分析需依靠编程等生物信息学专业的知识，导致成本的大幅上升和应用的严重受限。

技术实现思路

[0006]为了适用于二代测序，尤其是使用MiSeq高通量测序仪进行二代测序的要求，本专利技术提供了一种HIV
‑
1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的检测方法。
[0007]本专利技术提供了一种HIV
‑
1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的检测方法，所述方法包括：
[0008]提取样品RNA，并以提取的所述RNA为模板，逆转录成cDNA；
[0009]以所述cDNA为模板，进行PCR扩增，分别获得HIV
‑
1病毒的蛋白酶和逆转录酶区的DNA片段、整合酶区的DNA片段；
[0010]构建基因文库；
[0011]对构建的所述基因文库，采用二代测序技术进行测序，获取HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区的DNA序列组成，然后以HIV
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1参考株HXB2为参考序列，从而获得HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区的基因型。
[0012]本专利技术提供的HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的检测方法，操作步骤简单、成本低、效率高，非常适合二代测序、尤其是使用MiSeq高通量测序仪进行二代测序的要求。
附图说明
[0013]图1为本专利技术实施例4中，二代测序的深度和覆盖范围的示意图。
[0014]图2为本专利技术实施例4中，同一样本不同测序方法序列相似性的比较示意图。
[0015]图3为本专利技术实施例4中，二代测序方法精确性和可重复性验证的示意图。
[0016]图4为本专利技术实施例4中，基于一代测序与二代测序的配对样本突变位点检出情况示意图；其中图4A示出了一代测序检出突变位点者的二代测序结果(105例)，图4B示出了一代测序未检出突变位点者的二代测序结果(227例)。
具体实施方式
[0017]为使本专利技术的技术方案、目的和优点更加清楚，下面通过具体的实施例子对本专利技术做进一步的详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0018]本专利技术提供了一种HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的检测方法，所述方法适用于非诊断/治疗目的的HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的筛查。本专利技术通过对HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的筛查，可以为非诊断/治疗目的的HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区的低频耐药突变位点的筛查提供重要的参考。
[0019]本专利技术提供的HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的检测方法，包括如下步骤：
[0020]提取样品RNA，并以提取的所述RNA为模板，逆转录成cDNA；
[0021]以所述cDNA为模板，进行PCR扩增，分别获得HIV
‑
1病毒的蛋白酶和逆转录酶区的DNA片段、整合酶区的DNA片段；
[0022]构建基因文库；
[0023]对构建的所述基因文库，采用二代测序技术进行测序，获取HIV
‑
1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区的DNA序列组成，然后以HIV
‑
1参考株HXB2为参考序列，从而获得HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区的基因型。
[0024]根据本专利技术，所述方法包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应；其中，所述第一轮PCR反应以提取的所述RNA为模板，逆转录成cDNA，并且对逆转录成的cDNA进行初步扩增，以获取HIV
‑
1病毒的蛋白酶和逆转录酶区的DNA片段、整合酶区的DNA片段；所述第二轮PCR反应将所述第一轮PCR反应获得的HIV
‑
1病毒的蛋白酶和逆转录酶区的DNA片段、整合酶区的
DNA片段进一步扩增。
[0025]其中，所述第一轮PCR反应所采用的引物如下：
[0026]当用于扩增蛋白酶和逆转录酶区的DNA片段时：
[0027]正向引物1：5
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‑3′本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HIV
‑
1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区基因型的检测方法，其特征在于，所述方法包括：提取样品RNA，并以提取的所述RNA为模板，逆转录成cDNA；以所述cDNA为模板，进行PCR扩增，分别获得HIV
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1病毒的蛋白酶和逆转录酶区的DNA片段、整合酶区的DNA片段；构建基因文库；对构建的所述基因文库，采用二代测序技术进行测序，获取HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区的DNA序列组成，然后以HIV
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1参考株HXB2为参考序列，从而获得HIV
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1蛋白酶和逆转录酶区、整合酶区的基因型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应；所述第一轮PCR反应以提取的所述RNA为模板，逆转录成cDNA，并且对逆转录成的cDNA进行初步扩增，以获取HIV
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1病毒的蛋白酶和逆转录酶区的DNA片段、整合酶区的DNA片段；所述第二轮PCR反应将所述第一轮PCR反应获得的HIV
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1病毒的蛋白酶和逆转录酶区的DNA片段、整合酶区的DNA片段进一步扩增。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述第一轮PCR反应所采用的引物如下：当用于扩增蛋白酶和逆转录酶区的DNA片段时：正向引物1：5
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‑3′
，即序列表中的序列1；正向引物2：5
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ACTGARAGRCAGGCTAATTTTTTAG
‑3′
，即序列表中的序列2；反向引物：5
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ATCCCTGCATAAATCTGACTTGC
‑3′
，即序列表中的序列3；当用于扩增整合酶区的DNA片段时：正向引物1：5
′‑
GGRATYATTCARGCACAACCAG
‑3′
，即序列表中的序列4；正向引物2：5
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GCATTAGGRATYATTCARGCAC
‑3′
，即序列表中的序列5；反向引物：5
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TGGGATRTGTACTTCYGARCTTA
‑3′
，即序列表中的序列6；所述第二轮PCR反应所采用的引物如下：当用于扩增蛋白酶和逆转录酶区的DNA片段时：正向引物：5
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CTTTARCTTCCCTCARATCACTCT
‑3′
，即序列表中的序列7；反向引物：5
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CTTCTGTATGTCATTGACAGTCC
‑3′
，即序列表中的序列8；当用于扩增整合酶区的DNA片段时：正向引物：5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖玲洁，邢辉，冯毅，李苗苗，马鹏飞，杨晓震，郜培杰，史亚伦，阮玉华，邵一鸣，
申请(专利权)人：北京安普生化科技有限公司，
类型：发明
国别省市：