多种人兽共患病病原病毒的同步快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了多种人兽共患病病原病毒的同步快速检测试剂盒，包括针对尼帕病毒的正、反向引物和探针，针对轮状病毒的正、反向引物和探针以及针对狂犬病毒的正、反向引物和探针。用本发明专利技术试剂盒检测病毒，特异性强，检测结果可靠，可以实现在同一次PCR反应中同时检测出三种病毒，检测效率高，大大节省了时间、试剂，降低了成本，简便、快捷、灵敏。对于加强人兽共患病的疫病监测，以及预防人兽共患病的流行具有重要的意义。具有重要的意义。具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
多种人兽共患病病原病毒的同步快速检测试剂盒


[0001]本专利技术属于检测试剂盒
，具体涉及多种人兽共患病病原病毒的同步快速检测试剂盒。

技术介绍

[0002]人兽共患病(Zoonoses)是指在脊椎动物与人类之间自然传播的、由共同的病原体引起的、流行病学上又有关联的一类疾病。近年来，随着畜牧业和旅游业的飞速发展，许多人兽共患病的流行病学特征发生了改变，传播速度更快、传播范围更广。人兽共患病不仅严重威胁人类和动物的健康，还给农牧业带来巨大经济损失。
[0003]尼帕病毒是一种新出现的人畜共患病毒。尼帕病毒给感染者造成严重疾病，特征为脑部炎症或呼吸系统疾病。该病毒还可在猪等动物身上引起严重疾病，给养殖者造成重大经济损失。轮状病毒于1973年就被发现，造成婴儿与幼儿总计超过50％以上因为严重腹泻而住院治疗的案例，但是在公共卫生社群中它仍然没有被广泛地重视，特别是在发展中国家更是如此。除了对人类健康的影响之外，轮状病毒也会感染动物，是家畜的病原体之一。狂犬病是由狂犬病毒(Rabies Virus)引起的人畜共患的传染病。
[0004]早期防控是防止传染病输入播散、保障公共卫生安全、维护人类生命健康的前提条件，而开发快速、灵敏、特异的分子检测技术方法是早期防控的关键，同时也为指导临床、合理选择抗病毒药物提供重要依据。目前，针对人兽共患病病原病毒的检测技术方法主要包括病毒分离培养、血清学检测法、普通PCR法、等温扩增法以及荧光定量RT
‑
PCR法。其中等温扩增法和荧光定量RT
‑
PCR法是目前大多数实验室经常用到的分子检测技术方法。等温扩增法存在检测设备、检测试剂昂贵，极易发生交叉污染导致检测结果不确定性等突出问题，而且仅能实现单一病原体检测，无法实现单管多重检测等问题。荧光定量RT
‑
PCR法目前同样面临仅能实现单管单重病原体检测的问题，不仅增加了病原体筛查的次数，使得检测结果的时间大大延长，而且增加了操作过程，极大增大了检测成本，不利于疾病的快速诊断和早期防控。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供了多种人兽共患病病原病毒的同步快速检测试剂盒，能够同时快速地检测尼帕病毒、轮状病毒、狂犬病毒。
[0006]为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]提供多种人兽共患病病原病毒的同步快速检测试剂盒，包括针对尼帕病毒的正、反向引物和探针，针对轮状病毒的正、反向引物和探针以及针对狂犬病毒的正、反向引物和探针；
[0008]针对尼帕病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；
[0009]针对尼帕病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；
[0010]针对尼帕病毒的探针序列如SEQ ID NO.3所示；
[0011]针对轮状病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示；
[0012]针对轮状病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；
[0013]针对轮状病毒的探针序列如SEQ ID NO.6所示；
[0014]针对狂犬病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示；
[0015]针对狂犬病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；
[0016]针对狂犬病毒的探针序列如SEQ ID NO.9所示。
[0017]进一步地，还包括热启动Taq酶、c
‑
MMLV逆转录酶、RNasin、10
×
PCR Buffer、dNTPs、MgCl 2
。
[0018]进一步地，试剂盒的工作条件为：95℃2min，1个循环；95℃15s，56℃
‑
59℃30s，45个循环。
[0019]本专利技术的有益效果为：
[0020]用本专利技术试剂盒检测病毒，特异性强，检测结果可靠，可以实现在同一次PCR反应中同时检测出三种病毒，检测效率高，大大节省了时间、试剂，降低了成本，简便、快捷、灵敏。对于加强人兽共患病的疫病监测，以及预防人兽共患病的流行具有重要的意义。
附图说明
[0021]图1为实施例3中12例样品的扩增结果图；
[0022]图2为实施例3中阳性对照品扩增结果图；
[0023]图3为实施例3中阴性对照品扩增结果图。
具体实施方式
[0024]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。
[0025]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]下述实施例中，各引物和探针、阳性对照品均由生工生物工程股份有限公司合成。
[0028]病毒样本来源于中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。
[0029]实施例1
[0030]针对三种病毒的引物和探针设计：
[0031]根据GenBank提供的尼帕病毒、轮状病毒、狂犬病毒的基因组序列，通过Bioedit分析软件进行多序列比对分析，挑选高度保守的区段，分别选取尼帕病毒的N基因区域、轮状病毒的VP1蛋白区域，狂犬病毒的的N蛋白区域，应用Primer及AnnHyb多重引物设计软件设计了3对特异性引物和对应的3个探针。引物序列及探针序列见表1。
[0032]表1三组引物探针序列
[0033]编号名称序列(5'
‑
3')SEQ ID No.1尼帕病毒正向引物TCCATCAGCGTGGATAATTGATSEQ ID No.2尼帕病毒反向引物GATAGTGAACCTCATGGCATTATAG
SEQ ID No.3尼帕病毒探针CAATTCGCGACGTCATASEQ ID No.4轮状病毒正向引物CCTGGCTCGTGCGGATTSEQ ID No.5轮状病毒反向引物TGTAGTGCGTCCCCTCGACTSEQ ID No.6轮状病毒探针CAGACCAAGGAAGGACASEQ ID No.7狂犬病毒正向引物TGCGTCCTTAGTCGGTCTTSEQ ID No.8狂犬病毒反向引物GTGCCCACTCTGATTGCTSEQ ID No.9狂犬病毒探针CTCTGGTGCCCTTGCTAA
[0034]实施例2
[0035]多种人兽共患病病原病毒的同步快速检测试剂盒，包括实施例1中的三组引物探针、热启动Taq酶、c
‑
MMLV逆转录酶、RNasin、10
×
PCR Buffer、dNTPs、MgCl2。
[0036]引物探针浓度优化：将体系引物(25μM)和探针(25μM)从0.1μl依次递增至0.5μl，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多种人兽共患病病原病毒的同步快速检测试剂盒，其特征在于，包括针对尼帕病毒的正、反向引物和探针，针对轮状病毒的正、反向引物和探针以及针对狂犬病毒的正、反向引物和探针；所述针对尼帕病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；所述针对尼帕病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述针对尼帕病毒的探针序列如SEQ ID NO.3所示；所述针对轮状病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述针对轮状病毒的反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；所述针对轮状病毒的探针序列如SEQ ID NO.6所示；所述针对狂犬病毒的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示；所述针对...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兆，赵鑫坤，张士辉，李子钊，杨慕涵，张钰琨，姬广莹，姜佑恒，王硕，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：