马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT

【技术实现步骤摘要】
马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于病毒分子检测
，具体涉及一种马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
‑
PCR检测荧光探针、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]茄科植物包括番茄(Lycopersicon esclulantum Mill)、马铃薯(Solanum tuberosum L.)、辣椒(Capsicum annuum L.)、烟草(Nicotiana tabacum L.)等重要蔬菜、经济和大田作物，在世界范围内广泛栽培，具有重要的经济价值。特别是马铃薯和番茄，分别是世界第一和第二大具有经济要性的蔬菜，在全世界173个国家种植。但茄科植物也是重要的病毒和类病毒寄主，被病毒或类病毒侵染后产量或品质降低，造成严重的经济损失。类病毒是一类环状闭合的单链RNA分子，分子量约105Da，含246～401个核苷酸。类病毒是比已知病毒都小的能在宿主细胞内自主复制的病原体之一，它们不编码蛋白质，但会引起不同严重程度的症状，从轻微的影响，如几乎看不到的生长减缓，到变形、坏死或褪绿，以及受感染植物的严重发育不良。
[0003]马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid，PSTVd)是马铃薯“纺锤块茎”病的致病因子，属于马铃薯纺锤形块茎类病毒属的重要一员。PSTVd在细胞核内复制，并在植物韧皮部移动，导致一系列发病症状，发育迟缓是PSTVd感染的一个常见症状，受感染的植株块茎变小，呈细长或纺锤状；此外，这些块茎会形成凸起，均匀分布在整个表面，块茎萌发速度比未侵染植株慢。种薯作为一种营养繁殖作物，对其质量要求极高。通过块茎、插枝和植株的繁殖非常有利于PSTVd的传播，而且一旦发生感染将持续传播，用传统的方法(如茎尖剥离)很难阻绝，严重时可导致减产20％～60％，造成严重的经济损失。同时PSTVd也可通过花粉和种子在种质收集和杂交育种过程中传播，已证明通过番茄种子传播加速了PSTVd在国际上的扩散。
[0004]目前国内对PSTVd的检测方法主要依靠用互补探针核酸斑点杂交和往返电泳的方法进行检验，免疫电镜辅助检测。核酸斑点杂交和免疫电镜步骤复杂、操作难度较大，对检测人员检测素养以及实验室配套设备要求较高，且上述检测方法灵敏度较低，可能会造成PSTVd漏检风险，因此设计建立马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测体系，实现对其快速、精确检测非常必要，这对马铃薯纺锤块茎类病毒病毒监测预警以及国门生物安全等方面具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测引物、荧光探针、试剂盒及应用，采用的具体技术方案如下。
[0006]一种马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针，序列为：5'
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FAM
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CCGCTGGGCACTCCCCACCGTCCTTT
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BHQ1
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3'。
[0007]而且，与所述荧光探针配合使用的引物的核苷酸序列为：
[0008]正向引物：5'
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GGGTTTTCACCCTTCCTTTC
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3'；
[0009]反向引物：5'
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TGTTTCWRCDGGGATTACTCCTG
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3'。
[0010]一种马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测试剂盒，至少包括上述的荧光探针和引物。
[0011]以及上述马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针、引物或试剂盒在检测马铃薯纺锤块茎类病毒中的应用。
[0012]特别是从马铃薯纺锤块茎类病毒、金鱼草潜隐类病毒、辣椒小果类病毒、番茄顶缩类病毒、番茄褪绿矮缩类病毒和番茄雄性株类病毒这6种马铃薯纺锤形块茎类病毒属中鉴别出马铃薯纺锤块茎类病毒。
[0013]而且，试剂盒还包括TaqMan实时荧光PCR扩增预混液和阳性质粒。
[0014]而且，阳性质粒是将SEQ ID NO.1所示序列插入pGEM
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T载体中获得。
[0015]而且，用该试剂盒检测马铃薯纺锤块茎类病毒的方法为：
[0016]步骤1.提取待测样品的RNA并逆转录为cDNA；
[0017]步骤2.实时荧光PCR体系为：TaqMan实时荧光PCR扩增预混液12.5μL，上下游引物(10μmol/mL)各1.0μL，TaqMan探针(10μmol/mL)0.5μL，cDNA模板3.0μL，用ddH2O补充至总体积为25μL；实时荧光PCR反应条件为：50℃2min、95℃10min、95℃15s、60℃1min，40个循环；
[0018]步骤3.检测结果判定：Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，则结果为阳性；无Ct值或无扩增曲线，结果为阴性；Ct值>35时，重做该样本，若重做结果无Ct值为阴性，否则为阳性。
[0019]与现有技术相比，本技术方案的有益效果在于：1、提供一种马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测引物和荧光探针，适用于荧光定量PCR扩增，特异性好，灵敏度高，适合于在植物病害诊断领域广泛推广应用；2、通过实验验证该引物和荧光探针能准确地从6种马铃薯纺锤形块茎类病毒属中鉴别出马铃薯纺锤块茎类病毒，特异性达100％，这6种马铃薯纺锤形块茎类病毒属包括马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd、金鱼草潜隐类病毒CLVd、辣椒小果类病毒PCFVd、番茄顶缩类病毒TASVd、番茄褪绿矮缩类病毒TCDVd和番茄雄性株类病毒TPMVd；3、提供一种马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测试剂盒，该试剂盒操作简便，特异性强，灵敏度高，检测限达10fg/μL，并且在100ng/μL
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10fg/μL范围内定量准确；4、提供了试剂盒的检测方法，该检测方法通过标准曲线实现对供试材料中马铃薯纺锤块茎类病毒的定量检测；整个过程只需要1.5h左右，与常规PCR技术相比，大大缩短了检测时间；检测结果可由电脑软件直接读出，不需要进行反应后处理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的污染；5、对马铃薯纺锤块茎类病毒的进出口预警监测以及国门生物安全等方面具有重要意义。
附图说明
[0020]图1为马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)荧光定量PCR方法的标准曲线。
[0021]图2为马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)荧光定量PCR方法的敏感性分析的扩增曲线；对不同浓度参考品的线性与灵敏度进行实时荧光PCR检测分析，其中反应体系中cDNA含量分别为1：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针，其特征在于序列为：5'
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FAM
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CCGCTGGGCACTCCCCACCGTCCTTT
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BHQ1
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3'。2.根据权利要求1所述的一种马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针，其特征在于，与所述荧光探针配合使用的引物的核苷酸序列为：正向引物：5'
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GGGTTTTCACCCTTCCTTTC
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3'；反向引物：5'
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TGTTTCWRCDGGGATTACTCCTG
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3'。3.一种马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测试剂盒，其特征在于：至少包括权利要求1所述的荧光探针和权利要求2所述的引物。4.根据权利要求1～3中任一项所述马铃薯纺锤块茎类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针、引物或试剂盒在检测马铃薯纺锤块茎类病毒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用为从马铃薯纺锤块茎类病毒、金鱼草潜隐类病毒、辣椒小果类病毒、番茄顶缩类病毒、番茄褪绿矮缩类病毒和番茄雄性株类病毒这6...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振华，张建坤，张华，郑剑，徐文兴，李乔，徐雪，华益，熊永红，
申请(专利权)人：武汉理工大学华中农业大学，
类型：发明
国别省市：