两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组、试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组、试剂盒及其方法，属于生物技术领域，本发明专利技术所述引物及探针具有SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12所示的核苷酸序列，本发明专利技术通过引物设计、条件优化以及特异性、灵敏度检测，成功建立起家蚕主要病原核型多角体病毒、质型多角体病毒的双重荧光检测方法，该方法可用于两种主要家蚕病毒病的快速鉴别诊断，能够在耗时短的情况下实现不同病原检测及鉴定。实现不同病原检测及鉴定。实现不同病原检测及鉴定。

【技术实现步骤摘要】
两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组、试剂盒及其方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组、试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)能够引发家蚕血液型脓病，质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV)引发中肠型脓病，是蚕桑产业主要的病毒型病原体，严重危害了蚕桑产业的可持续发展。BmNPV引发的血液型脓病发病特征独特，血液呈现为乳白色，可直接通过肉眼观察识别感病情况；BmCPV引发的中肠型脓病导致家蚕中肠后部或整个中肠呈现乳白色。无论是何种病原，在家蚕感染早期都不会出现明显的、肉眼可判别的病理特征，晚期确诊后病原已经开始扩散，且目前生产上缺乏高效的、精确的、灵敏的、低成本的家蚕病原检测方法，导致蚕病的早期诊断陷入瓶颈。
[0003]目前病原的分子生物学诊断主要通过聚合酶链式反应(PCR)、抗原抗体反应、分子杂交等分子生物学技术对病原的保守核酸序列或特异性蛋白质进行定性或定量，从而达到对病原早期诊断的目的。其中PCR及在其基础上衍生出的新方法在病原的检测方面运用更为广泛，尤其是实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增(LAMP)等，针对一些难以分离培养、不易鉴别的病原微生物，它们检测灵敏度高、特异性强、准确度高，被广泛应用于医学、生命科学、农业、食品等领域。基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR具有特异性好、灵敏度高等优点，联合不同荧光基团的探针，具备同时检测、鉴别多种病原的优势。因此，基于此方法实现的家蚕主要病毒的检出，能够大大缩减检测周期及检测成本，并为家蚕行业的早期防控及流行病学提供有力支撑。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组；本专利技术的目的之二在于提供一种所述两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组在检测家蚕核型多角体病毒、质型多角体病毒中的应用；本专利技术的目的之三在于提供一种包含所述两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组的试剂盒。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]1、两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组
[0007]所述两种家蚕主要病毒为核型多角体病毒、质型多角体病毒，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的用于检测家蚕核型多角体病毒GP64基因的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示的用于检测家蚕质型多角体病毒RDRP基因的引物对；所述探针组为核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的用于检测家蚕核型多角体病毒GP64基因的探针
和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的用于检测家蚕质型多角体病毒RDRP基因的探针。
[0008]本专利技术优选的，所述用于检测家蚕核型多角体病毒GP64基因的探针的5
’
端修饰有FAM，3
’
端修饰有TAMRA，所述用于检测家蚕质型多角体病毒RDRP基因的探针的5
’
端修饰有HEX，3
’
端修饰有Eclipse。
[0009]2、包含所述两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组的试剂盒。
[0010]本专利技术优选的，还包括阴性对照和阳性对照。
[0011]本专利技术进一步优选的，所述阴性对照为DEPC水。
[0012]本专利技术进一步优选的，所述阳性对照为含有家蚕核型多角体病毒GP64基因片段和含有家蚕质型多角体病毒RDRP基因片段的质粒的混合物。
[0013]3、所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0014](1)收集待测样本，待测样本为家蚕血液、肠液或蚕卵内容物；
[0015](2)以步骤(1)得到的样本为模板，使用所述两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组进行实时荧光定量PCR扩增；
[0016](3)收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过待测样本中Ct值进行阳性判断，判断标准如下：若出现S型扩增曲线，且在FAM通道下有Ct≤35的读数，则待测样本中含有BmNPV病毒；若出现S型扩增曲线，且在HEX通道下有Ct≤35的读数，则待测样本中含有BmCPV病毒；若同时在不同通道出现S型扩增曲线，且得到Ct≤35的读数，则待测样本中同时含有BmNPV病毒和BmCPV病毒。
[0017]本专利技术进一步优选的，步骤(2)中，所述实时荧光定量PCR扩增的体系如下：反应体系为10μL；待测样本为1μL，PrimeDirect Probe RT
‑
qPCR Mix 5μL，SEQ ID NO.1～2、SEQ IDNO：9～10所示的引物、EQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示探针各为0.2μL，ddH2O补足至10μL，其中，引物及探针终浓度分别为0.2μM。
[0018]本专利技术进一步优选的，步骤(2)中，所述实时荧光定量PCR扩增的反应条件如下：95℃30sec；60℃5min；95℃5sec，60℃30sec采集荧光，40个循环。
[0019]本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过引物设计、条件优化以及特异性、灵敏度检测，成功建立起家蚕主要病原核型多角体病毒、质型多角体病毒的双重荧光检测方法，该方法可用于两种主要家蚕病毒病的快速鉴别诊断，能够在耗时短的情况下实现不同病原检测及鉴定。
附图说明
[0020]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：
[0021]图1为家蚕核型多角体病毒和家蚕质型多角体病毒同时阳性扩增曲线；
[0022]图2为家蚕核型多角体病毒阳性扩增曲线；
[0023]图3为家蚕质型多角体病毒阳性扩增曲线；
[0024]图4为阴性对照扩增曲线；
[0025]图5为两种家蚕主要病毒多重荧光定量PCR标准曲线；
[0026]图6为两种家蚕主要病毒多重荧光定量PCR灵敏度实验；
[0027]图7为两种家蚕主要病毒常规PCR检测灵敏度。
具体实施方式
[0028]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0029]实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非特别说明，本专利技术所用试剂和材料均为市购。
[0030]实施例1、引物筛选设计
[0031]提取BmNPV多角体病毒基因组DNA，具体方法为收集感染BmNPV家蚕，通过充分研磨以及3层纱布过滤获得粗滤液。对滤过液进行3次以上的差速离心和超纯水洗涤，分别为400g 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组，所述两种家蚕主要病毒为核型多角体病毒、质型多角体病毒，其特征在于，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的用于检测家蚕核型多角体病毒GP64基因的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示的用于检测家蚕质型多角体病毒RDRP基因的引物对；所述探针组为核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的用于检测家蚕核型多角体病毒GP64基因的探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的用于检测家蚕质型多角体病毒RDRP基因的探针。2.根据权利要求1所述的两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组，其特征在于，所述用于检测家蚕核型多角体病毒GP64基因的探针的5
’
端修饰有FAM，3
’
端修饰有TAMRA，所述用于检测家蚕质型多角体病毒RDRP基因的探针的5
’
端修饰有HEX，3
’
端修饰有Eclipse。3.包含权利要求2所述两种家蚕主要病毒的双重荧光PCR检测引物和探针组的试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照和阳性对照。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为DEPC水。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有家蚕核型多角体病毒GP64基因片段和含有家蚕质型多角体病毒RD...

【专利技术属性】
技术研发人员：董战旗，潘敏慧，方文暄，邓博远，陈鹏，鲁成，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：